О.В. Мосин

Название фитобиотехнология слагается из четырех слов греческого происхождения: phyton - растение, bios - жизнь, teken - искусство, logos - наука, слово. Следовательно, это наука об использовании растительных объектов в технике и промышленном производстве.

На первый взгляд выращивание растений (злаковых, лекарственных, декоративных и т. д.) в полевых условиях подпадает под рубрику "фитобиотехнология", однако, как и с животными, здесь отсутствуют специфические методы промышленного культивирования цельных растений в биореакторах. Таким образом, к фитобиотехнологическим процессам относят те из них, которые базируются на клеточном уровне, если даже клетки несут генетическую информацию, воспринятую ими в результате генно-инженерного эксперимента.

Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питательных средах in vifro в строго контролируемых условиях, все шире используют в фитобиотехнологии. Общирное царство растений - потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют неограниченные возможности для создания новых фитобиотехнологических процессов, в которых нуждается человечество.

В настоящее время царство растений на земном шаре включает порядка 300 000 видов. От рационального и бережного отношения к растениям зависит благополучное выживание человечества на планете Земля.

Представители царства растений (Plantae)

Надцарство - Eucaryota

Царство - Plantae

Отделы: 1. Водоросли - Algae

Типы: а) Красные - Rhodophyta

б) Золотистые - Chrysophyta

в) Желтозеленые - Xanthophyta

г) Диатомовые - Bacillariophyta

д) Динофлагелляты и криптомонады - Dinophyta

е) Бурые - Phaoephyta

ж) Зеленые - Chlorophyta

з) Эвгленовые-Euglenophyta

Некоторые биологи выделяют дополнительный
(девятый) тип пиррофитовых водорослей -
Pyrrophyta.

Печеночники и мхи - Bryophyta

Папоротники, плауны и хвощи - Pteridophyta

Семенные растения - Spermatophyta

Типы: а) Голосеменные - Gymnospermае

б) Покрытосеменные (цветковые) - Angiospermae.

В таком смысле фитобиотехнология является "палочкой-выручалочкой", способной освободить отдельные регионы и страны от импорта и интродукции растений, им не свойственных или совсем неспособных культивироваться в неподходящих климатических зонах. Это тем более резонно, когда речь идет о растениях - продуцентах биологически-активных соединений.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более дифференцированным организмам в сравнении, например, с бактериями, тем не менее они способны культивироваться в форме неорганизованной клеточной массы -каллуса. Каллусную ткань можно "заставить" формировать зародышеподобные структуры, почки, побеги, а на их основе - растения-регенераты. Все это происходит благодаря тотипотентности растительных клеток (от лат. totus - все, целый, potentia - сила, потенция). Понятие "тотипотентность" является клеточной характеристикой; в нем отражен потенциал клетки воспроизводить все типы клеток, присущих взрослому организму. Другими словами клетка обладает способностью воспроизводить целый организм.

Если в качестве биообъекта применяют изолированный зародыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то есть интегрированную систему, то все получаемые растения-регенеранты будут полностью соответствовать исходному растению, из которого была взята какая-либо интегрированная система из числа вышеназванных. Этим добиваются клонирования интересующих настоящих растений (см. схему ниже).

В случаях применения изолированных клеток и протопластов удается получать измененные варианты исходной формы, которые передают полученные новые признаки потомству. Этим добиваются возможностей искусственного создания новых форм растений, пригодных для выборки, или селекции (см. рисунок ниже).

В течение последних лет биотехнологам удалось массовое размножение культивируемых растений с уникальными характеристиками, а выращивание растительных клеток стало основой для получения многих природных веществ, образуемых различными растениями в качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды, алкалоиды и другие вещества).

Таким образом, клеточная и молекулярная биология растений составляет основу фитобиотохнологии, а главными направлениями стали создание новых форм полезных растений для сельского и лесного хозяйства, а также разработка промышленного производства химических веществ из растений.

В сравнении с микробной биотехнологией фитобиотехнология является совсем молодой научной дисциплиной, становление которой на промышленные рельсы происходит в настоящее время.

Рассмотрим ниже некоторые методы фитобиотехнологии, первый из которых наиболее важный -вегетативное размножение растений методом культур тканей. Метод культур тканей, или микроразмножение in vitro исключительно удобен для быстрого размножения и сохранения здоровых растений. Для этого производят отбор соответствующих эксплантов, подвергают стерилизации с последующим переносом на подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят эксплант; сезона года.

Установлено, что меристемные ткани, сердцевина луковиц, клубнелуковиц и корневищ, надежно защищенные листьями и чешуйками, являются стерильными. Перед удалением покрывающих структур их каждый раз протирают 70% этанолом. Открытые органы - источники эксплантов подвергают стерилизации ртуть- или хлор содержащими агентами.

Самая длительная стерилизация по времени не превышает 40 минут, в других случаях время заметно меньше. В усредненном варианте и применительно к различным культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70-95%), рекомендуют еще серебра нитрат (1%), бензалконий хлорид (0,01-0,1%) с длительностью экспозиции 0,1-5; 5-30 и 5-20 минут соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных частей растений) целесообразно промывать в растворах неионогенных ПАВ перед обработкой дезинфектантом. После этого ткань тщательно промывают водопроводной водой в течение 10-30 минут, а затем погружают в раствор дезинфектанта и нерезко взбалтывают в течение отведенного времени. После стерилизации растительный биообъект трижды промывают свежими порциями стерильной дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими процедурами: проведением стерилизации под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещением материала в 70% этанол до того, как обработать раствором другого дезинфектанта; использованием таких увлажняющих агентов как теин 80 или твин 20 в виде добавок к растворам дезинфектантов для снижения поверхностного натяжения и обеспечения более полного контакта дезинфектанта с материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные емкости для изоляции в асептических условиях органов из молодых растений. Фирма Sigma (США) к 1990 г. ввела новые мембранные наборы для культур растительных тканей. Их изготавливают из микропористой полипропиленовой мембраны, обработанной специальным ПАВ для улучшения прохождения питательных веществ. Мембранные наборы могут быть использованы при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в сравнении с агаризованной средой, лучше удается освобождать культуры от ингибирующего влияния фенольных веществ, выделяющихся в среду, а также предохранять клеточную линию от существенных повреждений при изучении метаболитов, продуцируемых культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку культуры могут поддерживаться в течение длительного времени без замены кулътуральных контейнеров. Ингредиенты (продукты) для культивирования растительных тканей должны производиться в соответствии с требованиями GMP. Этим гарантируется их высокое качество. Пригодность ингредиентов сред, обеспечивающих рост тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех клеточных линиях в 1-3-х пассажах. Избранные основные среды дополняют углеводами, витаминами, регуляторами роста (в зависимости от используемой клеточной линии).

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах. В принципе желательна стерилизация автоклавированием (121С) небольших объемов питательных сред, поскольку многие ингредиенты разрушаются при более продолжительном нагревании и давлении. Установлено, что температура выше 12 ГС может быть причиной нарушения качества сред, и, как следствие, плохого роста культур.

Некоторые ингредиенты в растворенном виде стерилизуют фильтрованием (через фильтры с порами 0,22 мкм в диаметре) и в виде стерильных растворов вносят в приготовленные среды перед их использованием. Питательные среды по своему составу достаточно разнообразны, однако в какой-то мере они и однообразны. В частности, их компоненты можно подразделить на 3 группы: источники органического углерода (чаще - сахароза), неорганические соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К числу последних относятся некоторые витамины комплекса В и растительные гормоны - цитокинины и ауксины. Почти универсальной средой для клеток различных видов является среда MS Т. Мурасиге и Ф. Скуга. Тем не менее, при работе с разными растительными объектами необходим специальный подбор ингредиентов сред для достижения поставленных целей. Питательные среды могут быть плотными за счет внесения 0,7-1% агар-агара и жидкими. Показано, например, что для микрокультуры ананасов предпочтительнее жидкие среды.

Микроразмножение in vitro можно осуществлять из существующих в растении тканей меристемного типа (зародыш, верхушка основного побега) или позже образующиеся пазушные побеги, равно как и из дополнительных меристематических тканей (точки роста, эмбриоиды) изолированных органов растений, где они формируются непосредственно в родительской ткани; из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

Если в качестве источника углерода используют в питательных средах сахарозу, то фотосинтез не нужен культуре, однако для морфогенеза и биосинтеза хлорофилла применяют люминесцентные лампы с интенсивностью освещения 1000-5000 люкс.

Важную роль играют регуляторы роста растений - ауксины и цитокины (растительные гормоны, или фитогормоны). Первые усиливают или поддерживают рост каллусов и корнеобразование in vitro; вторые стимулируют образование почек. Их используют в малых концентрациях, добавляя в стерильном виде к готовым питательным средам.

Ауксинами являются: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, р-хлорфеноксиуксусная кислота, индол-3-уксусная кислота, индрл-3-ацетил-Ь-аланин, индол-3-ацетил-аспарагиновая кислота, индол-3-ацетил-L-фенилаланин, индол-3-ацетилглицин, индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль, а-нафталинуксусная кислота. Среди цитокининов известны: аденин, 6-бензиламинопурин, 1-бензил-9-(2-тетрагидропиранил)-аденин, 6-у-у-диметилаллиламинопурин, 1,3-дифенилмочевина, кинетин, зеатин и некоторые другие. Смешанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберелловая кислоты, флороглюцинол; 2,2-диметилгидразид янтарной кислоты.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения к ним добавляют такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицетин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифампицин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Для растений характерно так называемое апикальное доминирование, при котором за счет регулирующего действия фитогор-монов верхушечная почка развивается быстрее, чем пазушные почки. Если культивировать кончик побега без фитогормонов, то развивается одиночный проросток со строго апикальным доминированием. Если же в среду внести цитокинин и засеять пазушные побеги, то они вырастают недоразвитыми, но с появлением пучка ростков, состоящего из второго, третьего и более порядков, которые можно разделить на составляющие и вновь выращивать на свежей среде до получения пучков таких побегов. Этот процесс можно вести до бесконечности, получая быстро или относительно быстро размножающиеся побеги желаемых растений.

Б большинстве случаев верхушечные (длиной 1-5 мм) и пазушные побеги заражены растительными вирусами, поэтому прибегают к использованию так называемой культуры верхушечных меристематических тканей, когда отрезают лишь 0,3-0,5 мм верхушки, содержащей меристему и 1-2 листовых примордия с последующей выдержкой при 30-40?С в течение 1,5-3 месяцев. Этот метод удачно использован и используется для оздоровления хозяйственно ценных растений.

С помощью метода культур тканей удалось значительно повысить коэффициент размножения многих садовых древесных (яблони) и травянистых декоративных растений (ирис, нарцисс, петуния, фиалка и др.), пользуясь придаточными побегами, а также каллусами, индуцированными фитогормонами и дающими побеги или эмбриоиды. Доступными для производства стали клетки барбариса - продуцента спазмолитика ятроризина, табака - продуцента убихинона-10.

Некоторые каллусы стабильно продуцируют растения - регенеранты в течение 10 лет (табак, хризантемы и др.), оставаясь при этом смесью нерегулярно дифференцированных клеток, среди которых постоянно содержатся диплоидные меристематические клетки, дающие стеблевые апексы или зародыши.

Перед высадкой проростков в грунт прибегают к стимуляции корнеобразования с помощью индолилмаслян.ой кислоты (-0,5-10 мг/л)

Фитобиотехнологи, занимающиеся микроклональным размножением растений, должны быть хорошо подготовленными в области биологии растений, с которыми приходится иметь дело, а также в области микробиологической техники работы. Лишь благодаря заинтересованности и профессиональному подходу к выполнению задания обеспечивается высокое качество конечного продукта (материала). Тем не менее необходимо помнить о трудностях, возникающих при микрокультивировании. К ним относятся: инфицирование растительных тканей вирусами и фитопатогеннымй бактериями (например, Erwinia carotowora), бактериальные и грибковые контаминации, ингибирование тканей фенольными и другими, например, летучими, соединениями, возрастание числа мутаций, и пр.

И все же микрокультивирование исключительно заманчиво не только на пути создания большого количества безвирусного'материала, но и массовости получения образцов в относительно короткие сроки (несколько тысяч в течение месяцев).

Микрокультивирование in vitro обеспечивает быстрое вегетативное размножение не только травянистых, но и древесных растений, также прибегая при этом к культуре побегов (например, для декоративных, лесных, плодовых и других деревьев) или каллусным культурам (гвинейская масличная пальма, цитрусовые и др.). Здесь важное значение имеет состояние ювенильности (от англ, juvenile - юношеский, юный), которое обычно растягивается на несколько лет и характеризуется сравнительной легкостью вегетативного размножения.

Для древесных растений известно также явление реювенильности, когда некоторые ткани взрослого растения проявляют свойства проростков, например, формируют придаточные корни. Реювенилизированные ткани все больше используются на практике для размножения отдельных покрытосеменных (например, эвкалиптов) и голосеменных деревьев (разные виды сосны). Ускорение реювенилизации может происходить под влиянием отдельных фенольных соединений (флороглюцин, квер-цетин, рутин), памятуя о том, что изменение уровня эндогенных фенольных соединений является составной частью регуляторных процессов, индуцируемых цитокининами.

Каллусные культуры древесных растений также перспективны как и каллусные культуры травянистых растений. Показателен пример с гвинейской масличной пальмой (Elaeis guineensis) - источником получения масла для населения Юго-Восточной Азии, Америки, Африки. К тому же эта пальма не размножается вегетативно. Генетико-селекционная работа по выведению более урожайных сортов на основании полового размножения занимает 15-20 лет. Вот почему получение каллусов, а затем - эмбриоидов и регенерантов масличной пальмы оказалось экономически выгодным делом. Обычно за 3 месяца удается выращивать из эмбриоидов побеги длиной 12 см (см. рисунок).

Рис. Процесс клонирования гвинейской масличной пальмы: 1 - верхушечные молодые листья (посевной материал), 2-5 - сменяемые питательные среды, в которых развиваются каллусы, эволюционирующие в эмбриоиды (4) и затем - в молодые растеньица (5), 6 - образование корней при очередном переносе растения на свежую питательную среду, из которой их пересаживают в грунт.

Учитывая тот факт, что в 1 см3 каллусной культуры содержится до 1 млн, клеток, каждая из которых способна трансформироваться в новое растение, становятся понятными все преимущества метода стерильного вегетативного размножения растений в лабораторных условиях на средах с фитогормонами при последующей пересадке их в почву. Отбирая нужные клетки, можно вывести новые сорта растений, удовлетворяющие запросы по одному или ряду показателей (устойчивость к микробным заболеваниям, урожайность, особая окраска цветов, повышенная продуктивность вторичных метаболитов и т. д.).

Для развития и формирования каллусных культур значительна роль не только фитогормонов, но и так называемыхэлиситоров (от англ, elect - выбирать) - БАБ, дерепрессирующих гены, и, как следствие, активирующих клеточные деления, сравнительно быструю дедиффереицировку специализированных клеток, сопровождающуюся активацией белкового синтеза. Полагают, что элиситорами являются углеводные молекулы, происходящие из гид-ролизованных гликанов клеточных стенок. Не исключена возможность экзогенного происхождения элиситоров, например, от микроорганизмов.

В случае выращивания клеток растений в глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые отвечали бы следующим требованиям: склонность к размножению в дезагрегированном состоянии, морфологическая выравненность и сохранность путей метаболизма. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным микроорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факторами, определяющими нахождение одиночных или аггломерирующихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в аггломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда поддержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в некотором приближении также оказываются совпадающими (lag-фаза, log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растянуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика - время удвоения их числа равно 1--3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20-30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатное" (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продуктивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Nicotiana tabacum).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2-3 г на 60-100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактуроназой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин - 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. .Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных питательных сред или использованием гомологичной ткани - "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рисунок). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкулътивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

Рис. Использование ткани-"няньки" (суспензионная культура) при выращивании колоний из одиночных клеток кукурузы или протопластов (схема): 1 -качалочная колба, 2 - колония, возникшая из отдельной клетки, 3 - фильтровальная бумага, 4 - металлическая сетка, 5 - суспензия клеток "кормящего слоя", б - подложка (пенополиуретан), 7 - питательная среда.

Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые или марлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами.

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию растения воробейника (Lithospermum erythrorhizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита - шиконина, являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем (рисунок). За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг коночного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой М-9, стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней - красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983г. составляла 4000 долларов за килограмм.

Схема культивирования воробейника в целях получения шиконина (1 - биореактор, 2 - подача стерильного воздуха, 3 -мешалка, 4 - питательная среда, 5 - выпуск отработанного воздуха, 6 - перенос среды в малый реактор, 7 - фильтрат, 8 - красные клетки, содержащие шиконин).

Не стоит забывать также, что растения - как многоклеточные организмы с огромной емкостью геномов, с половым путем размножения и многоступенчатыми программами развития - являются более сложными объектами для генноинженерных экспериментов, чем, например, вирусы, бактерии и дрожжи. Тем не менее, уже теперь достигнуты определенные успехи с растительными объектами и по прогнозам ученых США к 2010 году ожидается прирост урожайности сельскохозяйственных культур примерно на 60-70% по сравнению с началом 80-х годов текущего столетия в основном на основе использования методов генетической инженерии, когда стал возможным перенос отдельных генов от одного растения другому (в противоположность естественному половому процессу, при котором происходит замена целых блоков сцепленных генов).

Теперь расскажем как сделать генно-инженерные растения. В генноинженерном эксперименте необходимо изолировать конкретный ген, включить его в наследственный аппарат растительной клетки и регенерировать фертильное растение (способное к размножению) с измененным наследственным признаком. В народнохозяйственном аспекте важными признаками являются: высокая урожайность (или продуктивность), скороспелость, устойчивость к различного рода заболеваниям, засухе, к гербицидам и пестицидам, неполегаемость и др. К сожалению каждый из названных признаков контролируется, как правило, группой генов, что заметно усложняет проблему клонирования соответствующих генов. Однако, природа с давних пор "доказывает" нам, что генетическая инженерия также подвластна и ей. Примером тому служит инфекционная злокачественная болезнь (корончатые галлы) многих двудольных растений, вызываемая почвенной агробактсрией - Agrobacterium tumefaciens.Ta-кие однодольные растения, как пшеница, кукуруза, овес, рис, рожь, сахарный тростник, естественно устойчивы к заражению агробактериями.

В 1971 г. Р. Гамильтон и М. Фолл (США) пришли к выводу о том, что опухоль у растений индуцируется нуклеиновой кислотой. В 1974 г. Н. Ван Ларобеке, П. Энглер и др. (Бельгия) установили, что способность A.turnefacions вызывать образование корончатого галла с большими по размерам плазмидами (в длину 50-80 мкм в разомкнутом состоянии и с ММ 112-156 МДа - мегадальтон), названными Ti- п л а з м и д а м и (от англ, tumor inducing - вызывающий опухоль). Обычно они в клетке содержатся в 1-2 копиях и составляют примерно 4% ДНК от бактериального генома.

Однажды наведенный Ti-плазмидой опухолевый рост у растения не нуждается в ее дальнейшем присутствии для поддержания злокачественной пролиферации. Следовательно, выращивание и поддержание опухолевых клеток возможно в стерильной культуре (без агробактерий и без Ti-плазмиды), и, как установлено, без ауксинов и цитокининов, то есть без фитогормонов. При этом они образуют опины, отсутствующие у растений в нормальных условиях, и по которым можно определять опухолевую клетку. В зависимости от клеток корончатого галла могут образовываться агропин, нопалин или октопин. Поэтому и говорят соответственно: клетки агропинового, нопалинового или октопинового типа.

Фактическая ненужность Ti-плазмиды после индукции опухоли у растения связана с тем, что стерильные опухолевые клетки в своих хромосомах содержат ковалентно связанную часть этой плазмиды (около 10%), получившей название Т-ДНК (от англ, transferred - перенесенный), а применительно к клеткам A.tumefaciens с Ti-плазмидой - Т-участок бактерии. Т-ДНК содержится исключительно в ядре клеток корончатого галла.

Таким образом, на примере Ti-плазмиды виден перенос генов от прокариот к эукариотическим растениям в природных условиях (рисунок). Транскрипты интегрированной Т-ДНК в виде мРНК поступают из ядра в цитоплазму клетки, где включаются в реакции синтеза специфических белков на полирибосомах: ядерная ДНК-Т-ДНК -транскрипты -мРНК -полирибосома (трансляция) - белки - синтез опинов (гормон-независимый рост).

Схема переноса Т-ДНК из агробактерии в растение с последующим формированием корончатого галла (\ - бактериальная хромосома, 2 - Т-ДНК, 3 - Ti-плазмида, 4 - ядро растительной клетки, 5 - встроенная Т-ДНК, б -' корончатый галл); Б. Т-ДНК в Ti-плазмиде октопинового типа (продукты генов 1 и 2 ингибируют транскрипты побеги, гена 3 - ингибируют корни).

Каждый транскрипт определяется специфическим промоторным участком на Ti-плазмиде, узнаваемым полимеразой II растения - хозяина. Из рисунка видно, что функция генов 1-3 проявляется в неорганизованном росте клеток, поскольку тормозится формирование побегов и корней.

Фитопатогенные агробактерии способны вызывать 3 вида раковых опухолей у растений: корончатый галл, бородатый корень и стеблевой галл. Возбудителем каждого заболевания являются A.tumefaciens, A.rhizogenes и A.rubi соответственно, Проникая в поврежденное растение, патогенный микроорганизм с помощью Ti-плазмиды создает свою экологическую нишу и реализует "генетическую колонизацию" объекта - происходит гормон-независимый рост опухолевых клеток.

Ti-плазмиды оказались хорошими векторными системами для осуществления генноинженериых экспериментов с растениями, поскольку Т-ДНК этих плазмид обладает достаточно высокой эффективной емкостью (порядка 50 000 полинуклеотидов чужеродной ДНК могут быть перенесены и встроены с ее помощью в хромосомную ДНК растений), широким спектром хозяев, инфекционностью и стабильностью.

Перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды представлен на рисунке ниже.

Рис. Перенос гена (а) из хромосомы (6) Escherichia coli в растение (5) с помощью Т-ДНК (в) Ti-плазмиды (г) A.tumefacienS (2,3) в ядерную ДНК (д) растительной клетки (4).

Разработаны векторные системы на основе растительных хлоропластов и митохондрий, ДНК которых имеют гомологичные области с ядерной ДНК, что облегчает обмен участками между ними при выполнении генноинженерных экспериментов.

Заманчивы в качестве векторных систем и транспозоны. Их множество сулит многообещающие результаты в опытах с однодольными растениями, устойчивыми к заражению агробактериями и, следовательно, к восприятию Т-ДНК Ti-плазмиды.

В качестве векторов могут также использоваться вирусы растений. Их нуклеиновые кислоты реплицируются и проявляют свои функциональные свойства (экспрессируют) в клетках растений-хозяев, где потенциал вирусов и воспринимающих клеток объединяется и реализуется в приумножении организованных частиц патогена (например, для вируса мозаики табака в среднем 107 частиц на клетку, для вируса мозаики цветной капусты - порядка 104 частиц на клетку).

Однако вирусы как векторы обладают четырьмя существенными недостатками: они патогенны, их емкость небольшая, вирусы не способны встраиваться в хромосомы растительных клеток, они, в основном, видоспецифичны, то есть поражают определенный круг растений - хозяев.

В качестве векторов могут быть использованы также и вироиды
(см.), представляющие собой однонитевые цепи ковалентно связанных кольцевых РНК, включающих 270-300 нуклеотидов, лишенных оболочки. Вироиды поражают виноград, картофель, кокосовую пальму, томаты и другие растения как по вертикали (через зародышевые клетки), так и по горизонтали (распространяются по растительному организму через клеточный сок или переносятся механически).

Чтобы использовать вирусную (вироидную) РНК в качестве вектора, необходимо выполнить следующие последовательные операции.

Рис. Последовательнсть событий при использовании вирусной (вироидной) РНК в качестве вектора: 1 - обратная транскриптаза, 2 - ДНК-полимераза, 3 - встраивание в плазмиду(клонирование), 4 - включение чужеродного гена, 5 - инфицирование растений, 6 - транскрибирование с образованием инфекционной РНК и последующее заражение растения-хозяина.

Клон кДНК с встроенным геном может обладать инфекционностью и, как следствие, им заражают хозяйское растение. Если же кДНК с встроенным геном не обладает инфекционностью, то вирусный вектор может быть транскрибирован с образованием РНК, которая затем используется для заражения растения.

До сих пор ученые признают, что векторная система на основе цитоплазматического вируса мозаики цветной капусты (содержит двух-цепочечную ДНК) оказывается наиболее приемлемой в генно-инженерных экспериментах с растениями, хотя многое здесь остается неизученным (например, молекулярные механизмы проявления симптомов заболевания растения-хозяина от поражения вирусом, неопределенность диапазона растений-хозяев и возможность его расширения, неспособность векторной системы встраиваться в геном хозяина, и др.).

Если удается объединить возможности ДНК из вируса мозаики цветной капусты с Т-ДНК Ti-плазмиды, то такую векторную систему можно будет использовать на более широком круге растений-хозяев.

Объединение геномов клеток разных особей можно осуществлять при половой и соматической гибридизации. Первая из них способна реализоваться в природных и искусственных условиях, тогда как вторая - только в искусственных. Половая гибридизация давно известна человеку, и он с тех пор использовал ее для выявления новых сортов растений и для повышения их продуктивности.

Соматическая гибридизация базируется в основном на применении растительных протопластов, впервые полученных Дж. Клеркером в 1892 г. из листьев Stratiotes aloides (водное растение, именуемое телорезом).

Соматические клетки растений, как и интактные клетки бактерий или грибов (по лат. intactus -- нетронутый), в обычных условиях не сливаются друг с другом. Все они предварительно должны быть лишены клеточной стенки я трансформированы в протопласты.

Протопласты (от греч. protos - первый, plastos - вылепленный, образованный) - это клетки, лишенные клеточных стенок, способные сохраняться и метаболизировать, равно как и реконструировать клеточную стенку в подходящих условиях. Протопласты можно получать с помощью механических и биохимических (энзиматических) методов. В первых случаях добиваются плазмолиза растительных тканей, например, с помощью 0,1% раствора сахарозы с последующим разрезанием эпидермиса и освобождением протопластов в окружающую питательную среду. Энзиматические методы по-разному эффективны в получении протопластов. Здесь необходимо подбирать ферменты для каждого вида растений, однако наиболее часто используют целлюлазы, пектиназы, гемицеллюлазы как индивидуально, так и в комбинациях. Например, для получения протопластов из листьев Nicotiana tabacum листовую ткань без эпидермиса погружают в смесь ферментов, включающую 0,5% пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе маннита или сорбита; для получения протопластов из листьев клевера и люцерны используют 2-5% смесь гликаназ с пептидазами, и т. д.

В сравнительном плане более подходящим является энзиматический метод получения протопластов как более щадящий. Однако при любом способе важен подбор осмотического стабилизатора, без которого может наступить быстрый плазмоптиз протопластов (по лат. plasma - плазма, option - альтернатива). В качестве таких стабилизаторов могут быть применены растворы неорганических солей (СаС12, КС1, NaHPO4), органических гликолей (маннита, сорбита), моно- и дисахаридов (глюкозы, ксилозы, сахарозы) в ориентировочных концентрациях 0,3-0,8 М/л. Однако применительно к виду растения, из которого получают протопласты, необходимо подбирать индивидуальные условия для "протопластирования" (осмотический стабилизатор, рН среды, ГС). Эти требования сохраняются и в случаях получения протопластов из каллусных культур и клеточных суспензий.

В жизнеспособности выделенных протопластов большую роль играет физиологическая полноценность исходного растительного материала. Суспензионные культуры наиболее приемлемы для этих целей, будучи в конце логарифмической фазы роста (размножения) .

Полученные тем или иным путем протопласты либо используют для регенерации растения, либо их можно подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических гибридов.

Из растений, относительно легко регенерирующих из протопластов, можно назвать картофель, люцерну, маниок, рапс, табак. Для получения растений - регенерантов, высаженных в грунт, требуется, как минимум, 16-18 недель.

Растения, полученные из протопластов, могут отличаться достаточно выраженной изменчивостью по ряду интересующих нас признаков: урожайности, величине (размеру), морфологии отдельных частей, фотопериодичности и др. Как правило, это связывают с изменением числа и перестройками хромосом. Поэтому протопласты растений представляют собой интересные объекты и для изучения процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех случаях, когда исходные растения (источники клеток для протопластирования) способны гибридизоваться половым путем, но и тогда, когда заведомо известно, что клетки, подлежащие слиянию, относятдя к организмам с половой несовместимостью. Тем не менее, во всех случаях соматической гибридизации один из партнеров должен нести какой-либо маркерный признак (биохимический или другой), по которому возможно подтвердить достоверность получения гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцентных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возникают гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам, определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак цитоплазматической мужской стерильности (рисунок).

Рис. Слияние растительных протопластов и возможная сегрегация хлоропластов: 1 и 2 -протопласты разной видовой принадлежности; 3-гетерокарион; 4-гибриды; 1' и 2' - гибриды.

К настоящему времени из ряда растительных протопластов получены их безъядерные фрагменты - микропласты, окруженные тонопластной мембраной и включающие часть внеядерного генетического материала. Используя приемы соматической гибридизации, микропласты можно сливать с реципиентными протопластами. Таким образом, микропласты являются резервным материалом для расширения возможностей клеточной инженерии в фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация растительных протопластов с протопластами микроорганизмов и животными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии удалось доказать проникновение изолированных метафазных хромосом в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протопласты таких однодольных растений, как пшеница и кукуруза.

Также открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов).

Другая отрасль фитобиотехнологии - это создание растений, способных фиксировать атмосферный азот. Азотистые удобрения, вносимые в почву (наряду с другими питательными веществами) стимулируют рост и развитие растений. Обогащению почвы азотом помогают особые микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот из воздуха. Такие микробы подразделяют на две группы - свободноживущие в почве (например, Azotobacter chroococcum) и микробы - симбионты с корневой системой растений (например, Rhizobium meliloti). Те и другие осуществляют биологическую азотофиксацию. Число азотофиксаторов невелико, но от них в буквальном смысле слова зависит жизнь на нашей планете. С помощью микробов - азотофиксаторов ежегодно фиксируется около 17,5 x 107 тонн азота из воздуха. Основные компоненты системы азотофиксации являются сильными восстановителями: ферментный комплекс - нитрогеназа, ферредоксин или флаводоксин и АТФ. Микробы - азотофиксаторы трансформируют молекулярный азот в аммиак по следующей схеме:

Ассоциация клубеньковых бактерий из рода Rhizobium с бобовыми растениями является наиболее эффективной по фиксации N2 из воздуха. Ответственными за это являются nif-гены. Соответствующие биопрепараты бактериальных удобрений выпускают в различных странах мира.

К настоящему времени практически решена проблема увеличения nif-генов в микробах - азотофиксаторах, являющихся симбионтами донника (Rh. meliloti). За счет этого заметно усиливается азотофиксация и, как следствие, повышается урожайность растения - хозяина (схема).

Схема получения клеток Rhizobium meliloti, несущих дополнительные гены азотфиксации: 1 - плазмидная ДНК, 2 - рестриктаза, 3 - клетка Rh.meliloti, 4 - хромосома клетки, 5 -nif-гены, 6 -лигаза, 7 - рестриктирован-ная плазмидная ДНК, 8 - плазмидная ДНК с nif-геном, 9 - трансформация, 10 - клетка Rh.meliloti с nif-генами.

В настоящее время имеются также предпосылки к созданию методами генной инженерии злаковых растений - азотофиксаторов. Это сулит большие выгоды агрохозяйствам, занимающимся выращиванием, например, зерновых культур.

Прибегают и к простым искусственным ассоциациям азотофиксирующих бактерий с растениями, дающими ощутимые результаты по урожайности (например, цианобактерии Anaboena variabilis и табака).

В начале 90-х годов текущего столетия удалось создать подсолнечник, несущий гены бобов фасоли, кодирующих белок фазеолин. Такое химерное растение получило название "Санбин" (от англ, sun - солнце, bean - боб), оно способно синтезировать во многом полноценные белки. Каллусная культура санбина также обладает этой способностью.

Кроме генов фазеолина локализованы и выделены гены таких запасаемых белков, как зеин - белок кукурузы и легумин - белок гороха. Эти гены удается переносить в отдельные негомологичные растения.

Создан трансгенный рапс, содержащий гены отдельных нейропетидов человека, например, лейэпкефалина, связанного с геном альбумина семян рапса. С одного гектара земли, засеянного таким рапсом, можно получать до 3 кг неиропептида.

Важное значение имеют работы по созданию гербицидоустойчивых растений, не боящихся сорняков. Удалось перенести из представителей актиномицетов ген устойчивости к фосфаноцину в клетки сахарной свеклы; получены также устойчивые к гербицидам определенные сорта табака.

Токсические белковые кристаллы, образующиеся в клетках Вас. thuringiensis на основе матричного синтеза, убивают личинок лис то грызущих насекомых. Поэтому генноинженерная разработка по переносу гена бактериального токсина в геном табака увенчалась успехом в 1987 г. Экспрессия такого гена сопровождалась биосинтезом токсина, и личинки насекомых, поедающие листья, погибали в сравнительно короткий промежуток времени. По такому же принципу был создан инсектицидный трансгенный хлопчатник, содержащий ген ингибитора трипсина гороха коровьего; этот ген обусловливает синтез белка, блокирующего протеолитическую активность в пищеварительной системе у насекомых.

Создан новый сорт помидоров, длительно сохраняющийся без размягчения вследствие подавления активности фермента полигалактуронидазы. Методом генной инженерии получен ген, определяющий биосинтез анти-мРНК, которая ингибирует природную мРНК.

Благодаря удачному переносу генов фермента халькосинтетазы в петунию удалось получить растение с белыми цветами.

Сконструированы такие генноинженерные сорта сои, которые проявляют устойчивость к насекомым, гербицидам, вирусам и образуют больше запасных белков, обогащенных метионином.

В настоящее время на основе методов геномной инженерии получены межвидовые гибриды капусты, картофеля и табака с турнепсом, картофеля с помидором ("Помат"), помидора дикого вида, устойчивого к некоторым вирусам, и культурного сорта.

Весьма успешными оказались работы по созданию морозоустойчивых растений на основе их обработки культурой клеток Pseudomonas syringae, из которой элиминирован ген, ответственный за синтез специального белка, ускоряющего кристаллизацию воды с образованием льда. Обработка клубней картофеля таким "ледминус" микробом приводит к возрастанию их морозоустойчивости.

ЛИТЕРАТУРА

Бациллы. Генетика и биотехнология. Под ред. К. Харвуда. М., Мир, 1992.

Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М., Мир, 1989.

Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология, М., ВО Агропромиздат, 1990.

Биотехнология в 8-ми томах. Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Уч. пособие для вузов. М., Высшая школа, 1987-1988.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988,

Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X. Смита. М., ВО Агропромиздат, 1987.

Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. М.., МГУ, 1989.

Елинов Н. П. Химическая микробиология. М., Высшая школа, 1989.

Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.

Каратыгин И. В. Коэволюция грибов и растений. Санкт-Петербургский Гидрометеоиздат. С.-Пбг. 1993.