Мосин Олег Викторович: другие произведения.

Герпесвирусы и их репликация в клетке

Журнал "Самиздат": [Регистрация] [Найти] [Рейтинги] [Обсуждения] [Новинки] [Обзоры] [Помощь]
Peклaмa:
Конкурс фантастических романов "Утро. ХХII век"
Конкурсы романов на Author.Today

Летние Истории на ПродаМане
Peклaмa
Оценка: 7.61*8  Ваша оценка:
  • Аннотация:
    Вирус герпеса и заболевания, которые он вызывает: простой герпес, ветряная оспа, опоясывающий лишай и др. распространены на Земле широчайшим образом. Название герпеса было введено врачами Древней Греции, оно произошло от латинского глагола "герпейн", что означает "ползать". Объясняется такое название тем, что он распространяется расползаясь в виде характерных пузырьковых высыпаний на коже больного. Герпес был впервые описан в научной литературе врачами Древнего Рима приблизительно за тысячу лет до нашей эры. Проблемой, заостряющей на себе внимание общества, герпес стал именно в 20 веке. Этот коварный вирус находится в числе наиболее распространенных заболеваний человека, передающихся в виде вирусной инфекции. Герпес - это важная и труднорешимая проблема современного общества и медицины. Девять из десяти жителей в мире больны герпесом простого типа, а каждый пятый имеет проявления герпеса в виде простудной сыпи. Клинических проявлений герпеса существует довольно много, и все они разного вида: поражена может быть не только кожа, но и глаза, полость рта, нервная система больного герпесом, его дыхательная система и гениталии. Из-за своего нейродерматропизма герпес вызывает высыпания на коже, поражение слизистых оболочек организма. Деструктивные действия, которые герпес оказывает на центральную нервную систему больного, вызывают такие заболевания, как энцефалит и менингит. При герпеcе возможны также заболевания глаз; кератит или конъюнктивит. Простой герпес может выступать причиной патологий у беременных женщин во время созревания плода и родов, в некоторых случаях возникает спонтанный, непреднамеренный аборт или смерть плода еще в утробе матери, больной герпесом. Также у рожденного ребенка может иметься герпес в генерализованной форме. Исследователи отмечают связь между генитальным герпесом у мужчин (рак предстательной железы) и женщин (рак шейки матки). Статистика последних лет показывает, что частота заболеваний герпесом постоянно увеличивается - это не может не настораживать. В США, по данным исследований, генитальным герпесом болеют около 40 миллионов человек, причем за один год это число увеличивается в среднем на полмиллиона человек. У каждого пятого американца при обследовании обнаруживаются клинические признаки того, что он когда-то переносил инфекцию, вызванную вирусом герпеса. В России ситуация выглядит также далеко не лучшим образом - каждый год в российские больницы поступают около двух миллионов человек, больных герпесом. Чтобы знать этого опасного вируса, необходимо его исследовать. Данный научный обзор к.х.н. О.В.Мосина знакомит читателя с генетическими и биохимическими исследованиями герпесвирусов и механизма их репликации в клетке.

 [О.В.Мосин]

ГЕРПЕСВИРУСЫ И ИХ РЕПЛИКАЦИЯ.

О.В. Мосин

Принадлежность к семейству Herpesviridae определяется присутствием в составе вириона двухцепочечной линейной ДНК, кодирующей около 20 вирусных белков, икосадельтаэдрического капсида из 162 капсомеров, сборка которого происходит в ядре, и оболочки, образующейся из ядерной мембраны.Интерес к герпесвирусам связан с их способностью вызывать очень опасные инфекции, связанные с образованием пузырьков, фоликул и язв на слизистых оболочках человека и других животных, рекуррентные заболевания (Alphaherpesvirinae и особенно HSV), трансплацентарные инфекции с возникновением врожденных уродств (некоторые Betaherpesvirinae и особенно CMV), потенциально летальные лимфопролиферативные заболевания (Gammaherpesvirinae и особенно EBV).

Герпесвирусы очень широко распространены в природе. Среди высших эукариот редко встречаются такие, которые не подвергались бы заражению хотя бы одним из представителей этого семейства вирусов. Известно около 90 охарактеризованных герпесвирусов: семь из них выделены от человека [вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), цитомегаловирус (CMV), вирус ветряной ослы/опоясывающего лишая (VZV), вирус-зостер и вирус Эпштейна - Барр (EBV)], четыре - от лошади, четыре - от коров, два - от свиней [вирус псевдобешенства (PSV) и цитомегаловирус свиней], два - от кур (герпесвирус болезни Марека (MDV) и вирус инфекционного ларингоринотрахеита].

Герпесвирусы крайне разнообразны по биологическим свойствам. Некоторые из них имеют довольно широкий спектр хозяев, они очень эффективно размножаются, быстро разрушая заражаемые ими клетки (HSV-1, HSV-2, PSV). Другие, как EBV, имеют более узкий спектр хозяев. Некоторые герпесвирусы размножаются довольно медленно, и в этом случае они обладают менее выраженным цитопатическим действием (CMV).

Имеются Герпесвирусы (MDV, герпесвирус Люкке лягушек [95]), способные вызывать злокачественные опухоли. Одним из наиболее характерных свойств герпесвирусов является их способность оставаться в латентном состоянии в хозяине на протяжении всей его жизни, в котором они размножаются, вызывая иммунодефицитные состояния, аналогичные вирусу ВИЧ. Механизм, обеспечивающий латентность герпесвирусов, определяется действием специальных вирусных генов, а также ассоциацией вирусов с клетками подходящего типа [257].

Классификация

Представители сем. Herpesviridae разбиты на основе их биологических свойств из три подсемейства-альфа, бета и гамма (Alphaherpes-virinae, Betaherpesvirinae, Gammaherpesvirinae) [190]. Также проводились исследования по группировке вирусов по родам на основе нуклеотидных последовательностей вирусных геномов и серологической специфичности генных продуктов [260, 267]i

Alprraherpesvirinae

Члены этого подсемейства характеризуются широким спектром хозяев, относительно коротким репродуктивным циклом, быстрым распространением по клеточной культуре, эффективным разрушением зараженных клеток и способностью существовать в латентной форме, преимущественно, в нервных окончаниях ганглиях. В это подсемейство входит род Simplexvirtis (HSV-1, HSV-2, вирус мамиллита крупного рогатого скота) и род Poikilovirus [PSV, VZV и вирус герпеса лошадей типа 1 (EHV-1)].

Betaherpesvirinae

Для вирусов этого подсемейства характерен ограниченный спектр хозяев. Репродуктивный цикл идет долго, и заражение распространяется по культуре клеток медленно. Зараженные клетки часто увеличиваются в размере (цитомегалия), легко возникает и поддерживается последующая инфекция в культуре. Вирус может поддерживаться в латентной форме в секреторных железах, лимфорети-кулярных клетках, почках и других тканях. В состав этого подсемейства входит род Cytomegatovirus (CMV) и род Muromegalovirus (цитомегаловирус мышей).

Gammaherpesvirinae

Спектр хозяев, экспериментально устанавливаемый для вирусов этого подсемейства, ограничивается животными тех же семейств или отрядов, из которых выделен природный вирус. In vitro все вирусы этого подсемейства способны реплицироваться в лимфобластоидных клетках, некоторые из них могут вызывать литическую инфекцию в эпителиоидных клетках и фибробластах. Вирусы этой группы специфичны либо к Т-, либо к В-лимфоцитам. В лимфоцитах инфекционный процесс иногда останавливается на прелитической или литической стадии, т. е. продуктивное потомство отсутствует. Латентный вирус часто обнаруживается в лимфоидной ткани. В это подсемейство входят три рода: Lymphocryptovirus (например, EBV), Thetalymphocryptovirus (например, MDV) и Rhadinovirus (например, герпесвирусы обезьян Ateles и Saimiri).

Вот пожалуй все современные данные о классификации вирусов этого типа. Герпесвирусы не удается группировать ни по морфологии вириона, ни по общим признакам, характерным для их репродуктивного цикла. Существенные различия между ними обнаруживаются при анализе структуры их генома, специфических особенностей репродуктивного цикла и действия вирусов на клетки.

Структура вириона

Вирион вируса герпеса состоит из четырех структурных элементов:

1. сердцевины;

2. окружающего сердцевину икосадельгаэдрического капсида;

3. асимметрично распределенного вокруг капсида электроноплотного материала,, обозначаемого как тегумент; и наружной мембраны, или оболочки, окружающей капсид и тегумент (рис. 1).

Сердцевина зрелого вириона имеет тороидальную форму и содержит вирусную ДНК [84, 107, 211]. У некоторых герпесвирусов этот тороид как бы подвешен на белковом веретене из волокон, закрепленных на внутренней стороне капсида и проходящих через отверстие тороида. Точное расположение ДНК вдоль тороида неизвестно.

 [О.В.Мосин]

Рис. 1. Электронные микрофотографии нуклеокапсидов и вирионов HSV.

У всех герпесвирусов капсид обладает рядом общих структурных признаков: он имеет 100 нм в диаметре и состоит из 162 капсомеров. Пентамерные капсомеры в вершинах икосадельтаэдра детально не охарактеризованы. Размеры гексамерных капсомеров составляют 9,5x12,5 нм в продольном разрезе; от поверхности капсомера вдоль длинной оси проходит канал диаметром 4 нм [329].

Тегумент, который предложили так назвать американские учёные Ройзман и Ферлонг [262], находится между капсидом и оболочкой, практически не виден на тонких срезах, но при негативном окрашивании выглядит как волокнистый материал [204, 205, 277, 329]. Толщина тегумента варьирует в зависимости от местонахождения вириона внутри зараженной клетки; она больше в вирионах, скапливающихся в цитоплазматических вакуолях, и меньше в вирионах, сосредоточенных в перинуклеарном пространстве [74]. Имеющиеся данные указывают, что количество материала тегумента определяется вирусом, а не клеткой-хозяином [194], а его распределение чаще всего носит асимметричный характер.

Электронно-микроскопическое изучение тонких срезов показало, что наружная оболочка вируса имеет трехслойный вид [62]; по-видимому, она формируется из участков модифицированных клеточных мембран [4, 67, 205]. Присутствие липидов установлено путем прямого химического анализа вирионов [4, 16], а также следует из чувствительности вирионов к липидным растворителям и детергентам [100, 293, 297].

Оболочка вируса герпеса содержит многочисленные выступы - "шипы" (пепломеры); по сравнению с другими вирусами, имеющими липидную оболочку, у герпесвирусов этих "шипов" больше, но они короче по длине [329].

Для HSV сборка пустых капсидов, не содержащих ДНК,- явление редкое [262, 314]. Размер вириона у герпесвирусов колеблется от 120 до 300 нм. Эти вариации частично обусловлены разной толщиной тегумента. Другой причиной вариаций размеров является состояние оболочки. Неповрежденная оболочка вируса непроницаема и обеспечивает поддержание квазисферической формы вириона. Если оболочка повреждена, то она пропускает внутрь негативный краситель, и вирион выглядит как яичница-глазунья, причем его диаметр больше, чем диаметр интактного вириона.

Вирусная ДНК.

ДНК, выделенная из вирионов вируса герпеса, представляет собой линейную двухцепочечную молекулу. Выделенная ДНК во множестве мест имеет одноцепочечные разрывы и пробелы.

Если такую ДНК денатурировать щелочью [77, 150, 331] или формамидом, то образуются ее фрагменты. Согласно ряду сообщений, упакованная ДНК содержит в своем составе рибонуклеотиды [24, 112], но их присутствием нельзя полностью объяснить степень фрагментации ДНК.

ДНК разных герпесвирусов различаются по молекулярной массе и составу оснований. Молекулярные массы варьируют примерно от 80-106 до 150-106. Вариации молекулярной массы ДНК для каждого конкретного вида вирусов минимальны. Многие вирусные ДНК содержат на концах и в середине цепи повторяющиеся последовательности. В связи с разным числом этих повторов различия в молекулярной массе ДНК могут в некоторых случаях достигать 20 kb. У ДНК HSV после нескольких пассажей вне организма человека обнаружились вариации в молекулярной массе, достигающие 2x10-6. У штамма HSV-1 (HFEM) после многочисленных пассажей вне организма человека наблюдали делецию в 4 kb.

Состав оснований ДНК герпесвирусов в моль-процентах (гуанин+цитозин-пap) колеблется от 32 до 74. Кроме того, наблюдаются вариации в степени гомогенности нуклеотидной последовательности. Неоднородность популяции молекул ДНК по составу оснований может быть весьма незначительной (например, у HSV), но может быть и очень высокой (например, в ДНК герпесвирусов обезьян Saimiri и Ateles].

Организация нуклеотидной последовательности

Одним из наиболее интересных свойств ДНК герпесвирусов можно считать организацию нуклеотидной последовательности. По этому признаку все изученные к настоящему времени ДНК герпесвирусов подразделяются в основном на пять типов. Они схематически "оказаны на рис. 2.

 [О.В.Мосин]

Рис. 2. Схема организации генома у пяти типов вирусов Herpesviridae. Геномы типа А, В, С, D и Е представлены соответственно герпесвирусом кошачьего сомика (CCV), герпесвирусом саймири (HVS), вирусом Эпштейна - Барр (EBV), вирусом псевдобешенства (PSV) и вирусом простого герпеса (HSV). Горизонтальными линиями обозначены уникальные или последовательности. Повторы длиннее 1000 bр, если они не являются концевыми, показаны в виде прямоугольников. Стрелки внутри прямоугольника позволяют различать прямые и инвертированные повторы. Если подряд следует несколько серий крупных повторов, они обозначаются буквами (например, повторы b к с в ДНК HSV). Длинными вертикальными черточками обозначены концевые последовательности, известные для геномов типа В, С, D и Е. Все они относятся к группе прямых повторов. Для геномов типа Е концевые повторы обозначены как а-последоватсльности; они представлены в виде инвертированных повторов во внутренней части генома. Цифры указывают значения молекулярной массы (в миллионах дальтон). Цифры под вертикальными черточками указывают молекулярную массу, приходящуюся на один концевой повтор. Размеры полной последовательности могут варьировать от одного штамма к другому. Геномы типа А, В к С существуют только в одной ориентации (в виде одного изомера). В D- и Е-геномах последовательности, заключенные между инвертированными повторами, могут быть инвертированы, что дает два изомера для D-геномов и четыре изомера для Е-геномов.

Хотя первым герпесвирусом, для ДНК которого стала известна полная нуклеотидная последовательность, был EBV, функциональное значение организации последовательности ДНК лучше выяснено на примере вируса HSV, поэтому на последовательности ДНК именно этого вируса мы остановимся более подробно.

а) ДНК HSV удобно рассматривать как молекулу, состоящую из двух ковалентно связанных компонентов, длинного L-компонента и короткого S-компонента, на долю которых приходится 82 и 18% вирусной ДНК соответственно. Каждый компонент состоит в основном из уникальных последовательностей (UL и Us), фланкированных инвертированными повторами. Это заключение основано на том, что при отжиге каждой из интактных одиночных цепей образуются две одноцепочечные петли неодинаковой длины, соединенные отрезком двухцепочечной ДНК [282].

б) Инвертированные последовательности, находящиеся по обе стороны фрагмента UL, обозначают ab и ba; каждая из них содержит по 6% всей ДНК. Инвертированные последовательности по обе стороны Us обозначают а'с' и са: на долю каждой из них приходится 4,3% всей ДНК. На основании измерений длины двухцепочечных участков, образующихся при самоотжиге интактных цепей, и результатов изучения процесса частичной денатурации был сделан вывод о том, что они отличаются по составу оснований от участков ab и b'а' [315].

в) После отщепления одноцепочечных участков на двух концах под действием экзонуклеазы ДНК HSV можно перевести путем самоотжига в кольцевую форму [93, 281]. Концевые участки, ставшие одноцепочечными и поэтому способные замкнуть ДНК в кольцо при отжиге, обозначают как альфа-последовательности [315]. Для получения кольцевой ДНК оптимально отщепление экзонуклеазой 400-800 нуклеотидов [315]; эта оценка, полученная для HSVl-(F), находится в хорошем согласии с цифрой 500 bp, полученной в ходе прямого определения последовательности ДНК [202]. Длина альфа-последовательности варьирует от одного штамма к другому [52, 176, 311, 319]. Эти вариации частично обусловлены числом тандемных повторов, формирующих альфа-последовательность. Так, например, последовательность а вируса HSV-1 (F) состоит из прямого повтора 20 bp (DRl); уникальной последовательности из 65bp(Ub); отрезка из 12bp (DR2), повторенного от 19 до 23 раз; отрезка из 37 bp (DR4), повторенного от 2 до 3 раз; уникальной последовательности из 58bp(Uc) и второй копии DR1 (рис.3).

 [О.В.Мосин]

Рис. 3. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента ДНК на участке, соединяющем L- и S-компоненты HSV-1. Верхняя горизонтальная линия схематически отражает организацию последовательности ДНК HSV-1. Далее приведены нуклеотидные последовательности части участка b', всего участка а и части участка с. Цифры 1, 2 и 3 соответствуют штаммам HSV-1 (F) (201], 17 [52] и US [52]. Пробелами выделены позиции, в которых наблюдается дивергенция последовательностей.

г) Большинство штаммов HSV-1 содержат на конце S-компонента одну альфа-последовательность, тогда как на отрезке, соединяющем L- и S-компоненты, и на конце L-компонента их числа может варьировать [176, 319], Следующие друг за другом а-последовательности имеют общий DRl-участок [202]. Участок DR1 на L-конце содержит 18 bp, т. е. имеет выступающий из цепи неспаренный З'-нуклеотид, за которым следует участок из 18 bp. Концевой DR1 в составе уникальной альфа-последовательности на S-конце также содержит .подобный неопаренный З'-нуклеотид, за которым следует только 1 bp [202]. Наиболее простое объяснение таких нуклеотидных последовательностей состоит в том, что ДНК
зрелого вируса HSV-1 образуется путем разрыва конкатемерной или кольцевой ДНК на участке, где соседние последовательности соединены общим отрезком DR1 [202].

д) L- и S-компоненты могут быть инвертированы друг относительно друга. Вследствие этого ДНК HSV состоит из четырех изомеров, отличающихся только ориентацией L- и S-компонентов [54, 104]. По всей вероятности, эта инверсия обусловлена сайтспецифической рекомбинацией в районе альфа-последовательности, вызванной продуктами транс-действующих вирусных генов [200-203, 287]. В случае делеции внутренних инвертированных повторов образуется вирус [HSV-1 (F) I358], который размножается в клеточной культуре, но не имеет инвертированных форм ДНК [235]. Тот факт, что значительная часть упакованной ДНК находится в кольцевой форме, позволяет предположить, что внутренние инвертированные повторы и инверсии могут играть определенную роль в процессе упаковки линейной вирусной ДНК.

Гомология

Подробно исследована гомология между молекулами ДНК разных герпесвирусов, а также гомология между вирусной ДНК и ДНК клетки-хозяина. Эти области гомологии обнаруживаются у вирусов, сходных по организации ДНК, антигенной специфичности и биологическим свойствам. Например, вирусы рода Simplexvirus (HSV-1, HSV-2, вирус мамиллита крупного рогатого скота) содержат гомологичные участки, выявляющиеся даже при очень строгих условиях гибридизации [151, 299]. Подобного рода гомологичные участки найдены у вирусов рода Lymphocryptovirus (EBV, герпесвирусы павиана и шимпанзе) [85, 110]. Вместе с тем у ДНК вирусов, принадлежащих разным родам, гомологичные участки вообще или почти не обнаруживаются даже при весьма нестрогой гибридизации [19, 53, 178, 251].

Учёными обнаружена гомология между ДНК вируса герпеса и ДНК клеток хозяев. Наиболее полные данные получены для EBV [102, 103] и HSV-1 [226, 247].

Вариабельность ДНК герпесвирусов

Обнаружено два вида вариаций в нуклеотидных последовательностях ДНК-герпесвирусов. Это, прежде всего, вариации числа тандемных повторов. Так, на участке, соединяющем L- и S-компоненты, и на конце L-компонента число альфа-последовательностей оказывается неодинаковым даже в потомстве, полученном из одной вирусной бляшки [52, 176, 200, 202, 319]. Такие же вариации наблюдаются в тандемных повторах EBV [90, 271].

ДНК HSV, обработанная рестрикционными эндонуклеэзами, содержит помимо концевых фрагментов и тех, что размещены между L- и S-компонентами, еще ряд фрагментов переменной длины {например, Baml-il В-, Е- и N-фрагменты ДНК и HSV-1) [311]. Хотя организация последовательности в этих вариабельных участках мало изучена, скорее всего, они содержат тандемные повторы, тем более что флуктуации длин этих участков, по-видимому, носят обратимый характер.

Вариации второго типа проявляются в том, что в какой-то части молекул обнаруживаются сайты рестрикции, которых нет в других молекулах. Соответствующий анализ показал, что два изолята HSV-1 или HSV-2, выделенные из разных источников, никогда не бывают абсолютно тождественными, если между ними нет эпидемиологической связи [33, 261]. При размножении вируса в клеточной культуре распределение сайтов рестрикции приобретает более постоянный характер.

Вариации HSV, которые обнаруживаются при герпесе у людей, возможно, отражают способ передачи вируса и его эпидемиологию. HSV способен какое-то время находиться в латентной форме. Если же он активируется, то он может переносить инфекцию.

Поскольку вирус постоянно сохраняется в популяции хозяина, он накапливает нелетальные мутации, которые далее передаются потомству. Изменчивость в распределении сайтов рестрикции используют при изучении процессов передачи вируса и его поведения в популяции человека [31-33, 174, 264].

Полипептиды, входящие в состав вириона.

По имеющимся данным очищенные вирионы нескольких герпесвирусов содержат от 15 до 35 видов структурных белков [36, 57, 227, 293, 304]. На рис. 4 представлен радиоавтограф полипептидов HSV-1 и HSV-2, электрофоретически разделенных в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле.

 [О.В.Мосин]

Рис. 4. Электрофореграмма полипептидов и гликополипептидов, присутствующих в очищенных вирионах HSV-1 (F) и HSV-2 (G). Вирионы выделены из клеток НЕр-2, которые после заражения были инкубированы с 14С-глюкоз-амином (g) или с 35S-метионином (аа). Среди полос, содержащих 353-метионин, точками отмечены полосы, соответствующие главному капсидному белку (с мол. массой - 155К). Гибсон и Ройзман [881 идентифицировали пять других полипептидов в интервале мол. масс от 25К до 53К, присутствующих в нуклеокапсидах до их одевания в оболочку. На электрофореграмме их положение не указано: это сделать довольно трудно, поскольку они мигрируют вместе с другими полипептидами. Большая часть полипептидов вириона и все гликополипсптиды попадают в состав вириона к моменту завершения его одевания в оболочку. Гликополипептиды HSV-I и HSV-2, имеющие одинаковые буквенные обозначения, родственны в антигенном отношении и кодируются ко-линеарными генами (см. обзор [291]). Кажущиеся молекулярные массы гликополипептидов находятся в интервале от 55-60К для gD HSV-1 и HSV-2 до 130К для gC HSV-1 и HSV-2. Обратите внимание, что у gC HSV-1 (gC-1) кажущаяся молекулярная масса заметно выше, чем у gC HSV-2 (gC-2). Другие гомологи в HSV-1 и HSV-2 имеют близкие размеры. Для gG гомологи в HSV-1 и HSV-2 не идентифицированы. Небольшое количество радиоактивной метки, попавшей из 14С-глюкозамина в немаркированные полосы профиля HSV-2 (G), обусловлены нейтрализацией меченых продуктов катаболизма 14С-глюкозамина; неизвестно, являются ли эти полипептиды гликопротеинами [336, 337]. По данным [36]вирионы HSV-1 и HSV-2 содержат на поверхности четыре основных гликопротеина, обозначаемые как gB (VP7-VP8,5), gC (VP8), gD (VP17 и VP18) HgE (УР12,3,и VP12,6) [36,106,290, 291, 295].

Есть сообщение о существовании еще одного гликопротеина HSV-2, gG [266]. Гликопротеины gB, gC, gD и gE сульфатированы [122]. В гликопротеин gE, являющийся Fc-рецептором [13, 222, 223], включается 3Н-пальмитат, - по-видимому, в его составе имеются жирные кислоты [134].

В препаратах очищенного вируса часто присутствуют предшественники вирионных белков, поэтому число полос, которые дают в денатурирующих гелях гликозилированные полипептиды, увеличивается.

Функция гликопротеина gC не ясна; известно только, что он обладает СЗb-связывающей активностью [81]; мутанты, лишенные способности экспрессировать gC, остаются жизнеспособными [107, 115], но часто они дополнительно несут мутации syn-, вызывающие слияние зараженных клеток в поликариоциты [148, 186,255,270].

Гликопротеин gB, по всей видимости, обеспечивает происходящее на ранних стадиях заражения слияние оболочки вируса с плазматической мембраной [175, 273].

Функции гликопротеинов gD, gE и gG неизвестны.

Капсид состоит по меньше мере из шести полипептидов [88]. Пустые капсиды, меньше по размерам, и в них недостает по крайней мере одного белка [88, 89], который в ДНК-содержащих капсидах расположен на поверхности [26] и подвергается посттрансляционной модификации во время или сразу после образования оболочки.

Размещение остальных белков вириона неизвестно; вероятно, они располагаются на внутренней стороне оболочки и связывают белки оболочки с тегументом. В очищенном вирусе присутствуют АТРаза и протеинкиназа [63, 171, 268]. Протеинкиназа активируется при разрушении оболочки неионными детергентами и остается в составе капсидтегументных структур [171].

Репликация герпесвирусов

Схема репликации герпес-вируса показана на рис. 5.

Рис. 5. Схема репликативного цикла вируса простого герпеса.

 [О.В.Мосин]

Заражение начинается с прикрепления вируса к клеточным рецепторам. Вирус проявляет большое сродство к клеткам слизистой оболочки эпителия. Вслед за этим происходит слияние оболочки вируса с плазматической или эндосомной мембраной, и лишенный оболочки капсид переносится к порам в ядерной мембране, через которые ДНК вируса попадает в ядро.

Транскрипция и репликация вирусной ДНК, а также сборка капсидов происходят в ядре. Вирусная ДНК транскрибируется в ходе репродуктивного цикла клеточной РНК-полимеразой II при участии на всех стадиях цикла ряда вирусных факторов. Синтез продуктов вирусных генов строго регулируется; экспрессия вирусных генов координирована и представляет собой последовательно развернутый во времени каскад событий. Несколько более 50 хорошо представленных генных продуктов образуют по меньшей мере пять групп, отличающихся друг от друга по характеру регуляции синтеза на транскрипционном и посттранскрипционном уровне.

Некоторые из генных продуктов относятся к ферментам или ДНК-связывающим белкам, непосредственно вовлеченным в синтез ДНК. Основная масса вирусной ДНК синтезируется по механизму катящегося кольца. Одновременно могут происходить изомеризация и упаковка ДНК.

Сборка вируса складывается из нескольких стадий: внутри уже сформировавшихся капсидов упаковывается ДНК, вирусы созревают и выходят из клетки через плазматическую мембрану. Весь процесс может длиться от 12 ч для вируса псевдобешенства до более чем 70 ч для цитомегаловируса человека. Репликация HSV требует около 18 ч.

Начальные стадии заражения

Относительно событий, предшествующих транскрипции вирусных генов, сведения весьма расплывчаты и фрагментарны. Учёные считают, события на начальных стадиях заражения происходят по следующей схеме.

Прикрепление

Герпесвирусы прикрепляются к специфическим рецепторам на клеточной поверхности, которые еще не идентифицированы. Все представления о специфичности клеток в этом отношении основываются на исследованиях, подобных тому, что лишь часть клеток человека (например, только В-лимфоцнты) содержат рецепторы для EBV [140, 154, 159, 326]. Попытки найти клетки животных, не содержащие рецепторов для HSV, успеха не дали; тем не менее кроме человека "естественному" заражению этим вирусом подвержены только шимпанзе [193]. Ничего не известно и об антирецепторах- тех компонентах поверхности вирусной частицы, которые связываются с рецепторами.

Проникновение капсида в зараженную клетку

Прикрепление вируса активирует белок, находящийся на поверхности вируса и вызывающий слияние оболочки вируса с плазматической мембраной. Предполагают [204], что происходит именно слияние оболочки с плазматической мембраной, а не фагоцитоз. Это согласуется с обнаружением на клеточной поверхности Fc-рецепторов оболочки вириона, в том числе и в тех случаях, когда проникновение вируса не приводит к экспрессии вирусных генов [221].

Присутствие в оболочке вируса активируемого компонента, вызывающего ее слияние с клеточной мембраной, подтверждается также тем, что температурочувствительный мутант HSV-1 по гликопротеину В адсорбируется на клеточной поверхности, не проникая внутрь клетки. Если после такой адсорбции химически индуцировать слияние оболочки вируса с плазматической мембраной, происходит заражение и вирус дает потомство [273]. Утрата чувствительности к нейтрализации, обусловленная проникновением адсорбированного вируса в клетку, происходит очень быстро [123].

Выход вирусной ДНК из капсида

После проникновения в клетку капсид транспортируется к порам в ядерной мембране, а затем под контролем вирусных факторов вирусная ДНК выходит в нуклеоплазму. Капсиды температурочувствительного мутанта HSV-1 (HFEM) tsB7 скапливаются у ядерных пор, и выход вирусной ДНК наблюдается только после понижения температуры до пермиссивного уровня [12]. На ранних стадиях заражения вирусом дикого типа у ядерных пор легко обнаруживаются пустые капсиды. Следуя аналогии с заражением аденовирусом, можно предположить, что транспорт капсидов герпесвирусов к ядерным порам осуществляется при участии цитоскелета [47]. Родительская вирусная ДНК накапливается в ядре.

Какие компоненты вириона необходимы для репликации вируса в зараженных клетках?

Трансфекция клеток интактной вирусной ДНК приводит к формированию вирусного потомства [94, 164, 282]. Однако удельная инфекционность вирусной ДНК на много порядков ниже по сравнению с инфекционностью вириона, и длится репродуктивный цикл дольше. Кроме того, нет уверенности в том, что трансфекция клеток влечет за собой ту же последовательность событий, которая составляет репродуктивный цикл при заражении клетки вирионом.

Относительно ДНК остальных компонентов вириона, то они выполняют четыре функции: защищают ДНК от внешних воздействий, облегчают проникновение в клетку и, кроме того, способствуют отключению на ранних стадиях заражения синтеза клеточных макромолекул [70, 214-216, 253, 265, 306-308]. Четвертая функция связана с участием в процессе репликации вируса; этот вывод основан на действии одного из компонентов вириона, индуцирующего гены альфа-первую группу экспрессируемых вирусных генов [11, 238]. Поскольку это событие происходит в ядре, можно заключить, что в ядро вместе с ДНК проникают еще какие-то компоненты вириона. Белки, участвующие в этом процессе, окончательно не идентифицированы. Престон и Нотарианни [244] наблюдали ADP-рибозилирование капсидного белка VP23 [89, 293] в ядрах зараженных клеток и высказали предположение о транслокации в ядро этого белка. Согласно полученным данным, белок VP23 либо сам является компонентом находящейся в вирионе протеинкиназы, либо действует на субстрат, фосфорилируемый или дефосфорилируемый этим ферментом [171].

Экспрессия вирусных генов

Транскрипция вирусной ДНК происходит в ядре, тогда как все вирусные белки, синтезируются в цитоплазме. Число синтезируемых полипептидов для HSV не превосходит 50 [45, 116, 208].

В клетках, подвергшихся продуктивному заражению HSV, регуляция экспрессии вирусных генов имеет три характерных свойства: а) белки HSV образуют по крайней мере пять координирование регулируемых групп-и в отношении необходимых условий их синтеза, и в отношении кинетики синтеза; б) абсолютная скорость синтеза и количество каждого из белков могут варьировать; в) указанные группы белков синтезируются последовательно одна за другой, причем синтез носит каскадный характер [116, 118-120, 161, 230, 292].

Первыми экспрессируются альфа-гены, кодирующие пять альфа-белков, с номерами 0, 4, 22, 27 и 47. Синтез этих полипептидов достигает максимальной скорости через 2-4 ч после заражения, а затем скорость синтеза уменьшается [118]. Функционирование альфа-белков служит необходимым условием для синтеза последующих полипептидов. Так, клетки, зараженные мутантами по гену альфа-4, при непермиссивной температуре накапливают только альфа-полипептиды [158, 245].

Механизм, посредством которого белок альфа-4 регулирует экспрессию последующих генов, неизвестен. Мутанты по этому гену легко поддаются отбору, причем достаточно большая часть гена альфа-4 оказывается затронутой температурочувствительными мутациями [56, 158, 245]. Характерная черта этих мутантов заключается в том, что при переводе зараженных ими клеток из пермиссивных условий в непермиссивные возобновляется синтез альфа-белков [241]. Среди альфа-генов мутациям подвержен только ген альфа-4. Однако в экспрессии генов HSV играют роль и другие альфа-гены. Например, это относится к гену альфа-22. Мутанты HSV-1 (R325 и R328), содержащие делецию этого гена [237], размножаются так же эффективно, как и дикий тип в перевиваемых клетках человека и приматов, но не размножаются в перевиваемых клетках грызунов и в растущих или покоящихся диплоидных клетках человека. В культуре покоящихся диплоидных клеток человека мутанты с делецией гена альфа-2 неспособны переходить из одной клетки в другую, что может быть связано с нарушением образования оболочки.

Полипептиды групп бета-1 и бета-2 достигают максимальной скорости синтеза примерно через 5-7 ч после заражения [118]. Группа бета-1, в которую, в частности, входят полипептиды бета-1-6 (компонент вирусной рибонуклеотидредуктазы) [127] и бета-1-8 (главный ДНК-связывающий белок), появляются уже на ранних стадиях заражения, и в прошлом их ошибочно включали в группу альфа-белков. Они отличаются от альфа-белков тем, что для их синтеза необходимо присутствие функционирующего белка альфа-4. К полипептидам группы бета-2 относятся вирусная тимидинкиназа (ТК) и ДНК-полимераза.

Гамма-полипептиды подразделяются на две группы-гамма-1 и гамма-2 - различающиеся по условиям синтеза: если полипептиды группы гамма-1 могут образовываться в отсутствие синтеза вирусной ДНК, то для образования гамма-2-полипептидов необходима амплификация вирусной ДНК [41, 118, 121, 333]. Представителем группы гамма-1 является белок гамма-1-5 - главный белок, из которого формируется капсид, а также гликопротеин В. Гликопротеин С является примером белков группы гамма-2. Следует подчеркнуть, что группа гамма-1 существенно отличается от бета-полипептидов: хотя синтез гамма-1-полипептидов идет и в отсутствие вирусной ДНК, они образуются в значительно меньших количествах, чем при нормальной продуктивной инфекции, тогда как синтез бета-полипепти-дов нисколько не подавляется в присутствии ингибиторов синтеза ДНК и идет нормальным образом в клетках, зараженных ДНК-мутантами при непермиссивных температурах.

Транскрипция: структура мРНК HSV

Транскрипция ДНК HSV осуществляется ферментом РНК-полимеразой II [42]. Вирусные РНК кэпируются, метилируются и полиаденилируются; иногда выявляются и неполиаденилированные РНК той же последовательности, что и аденилированные [6, 9, 10, 285, 286, 303].

Внутреннее метилирование характерно для ранних, но не для поздних РНК [10]. мРНК HSV-1 могут различаться и по количеству, и по стабильности [76, 79, 131, 285, 286]. Как правило, мРНК альфа-генов более стабильны по сравнению с мРНК гамма-генов [333].

Вирусные мРНК могут сохраняться и по окончании трансляции [136, 161, 162].

Хотя мРНК, о которых здесь идет речь, функционируют в клетках высших эукариот, лишь малая часть мРНК HSV-1 подвержена сплайсингу. Открыты гены, перекрывающиеся по 5'- или З'-концевой последовательности, но таких генов немного [99, 198, 316]. Обращает на себя внимание наличие множественных сайтов инициации транскрипции отдельных генов HSV [82, 210,280,322,338].

Функции вирусных генов

Функциональная организация генома герпесвирусов

Об организации геномов HSV-1 и HSV-2 известно довольно много. Знания о функциональной организации геномов вируса HSV в основном опираются на четыре основных источника данных: анализ рекомбинантов HSV-1 и HSV-2 [187, 207, 208]; восстановление жизнеспособности мутантов путем трансфекции клеток интактной мутантной ДНК и фрагментами ДНК, полученными при действии рестрикционных эндонуклеаз на геном дикого типа [156, 158, 209, 224]; перенос доминантного или поддающегося регистрации маркера из одного генома в другой с помощью фрагментов, отщепленных эндонуклеазами рестрикции [156, 160, 238, 270]; экспрессия генных продуктов очищенной мРНК или фрагментов ДНК в подходящей системе [41, 111, 166, 179, 237, 238].

Наиболее фундаментальный вывод заключается в том, что порядок экспрессии генов во времени не соответствует порядку их расположения в геноме. Приводимые ниже данные касаются организации и структуры генов HSV, но они отражают и некоторые общие черты генов герпес-вирусов.

1. альфа-гены располагаются вблизи концов L- и S-компонентов [1, 139, 179, 208, 210, 246, 320, 322]. Гены а0 и а4 находятся в составе инвертированных повторов L- и S-компонентов соответственно, так что в геноме дикого типа они представлены двумя копиями. Но достаточно и одной копии: мутант H3V-1 (1358) с делецией большей части внутреннего инвертированного повтора сохраняет жизнеспособность [235]. ts-мутантов по гену а0 не обнаружено, а у мутантов по гену a4 экспрессия ts-фенотипа связана с мутациями в обеих копиях [158]. Ген а27 расположен вблизи внутреннего инвертированного повтора L-компонента. Гены а22 и а47 частично занимают область инвертированных повторов S-компонента. Из пяти альфа-генов только гены а22 и а47 дают мРНК, подвергающиеся сплайсингу; возможно, они перекрываются с другими генами [1, 179, 181, 321, 322]. альфа-гены в кольцевой ДНК образуют два кластера: в состав первого входят гены 27, 0, 4 и 22, а в состав второго - гены 47, 4 и 0. Несмотря на такую кластеризацию, каждый альфа-ген имеет свою промоторно-регуляторную область и собственные сайты инициации и терминации транскрипции [179-182J.

2. Гены бета и гамма рассеяны по L- и S-компонентам. Учёным удалось обнаружить только два кластера функциональных генов, но их реальная роль пока неясна. Так, бета-гены, кодирующие ДНК-полимеразу и ДНК-связывающий белок, располагаются вблизи начальной точки репликации ДНК в L-компоненте, тогда как несколько гамма-генов, кодирующих мембранные
белки, располагаются в пределах уникальных последовательностей S-компонента [167, 266, 270, 323]. Хотя известно несколько случаев перекрывания генов на 3- или 5-концах [58, 254, 322], у герпесвирусов примеров такого рода перекрывания, равно как и примеров сплайсинга генов [316], намного меньше по сравнению с аденовирусами и паповавирусами.

3. Среди генов герпесвирусов наиболее полно исследован ген ТК HSV-1 - в основном благодаря легкости обнаружения соответствующей ферментативной активности даже на фоне активности фермента хозяина. Структурные характеристики гена ТК типичны и для генов вируса герпеса, и для генов, экспрессируемых в клетках высших эукариот. Ген ТК содержит 5'-концевую промоторно-регуляторную нетранскрибируемую область; транскрибируемую, но нетранслируемую 5-последовательность; транскрибируемые и транслируемые последовательности; З'-концевую транскрибируемую нетраслируемую область и З'-последовательность, необходимую для полиаденилирования транскрипта.
Из структурных свойств гена ТК два представляют особый интерес. Во-первых, имеются два сайта инициации транскрипции -обнаружены мРНК, синтез которых инициируется с того и другого сайта [55, 243, 338]. Роль этих сайтов в экспрессии гена при инфекции пока неясна.

Другой интересной особенностью является структура 5'-концевой нетранскрибируемой области. Мак-Найг с соавторами [195-197] идентифицировали в пределах 150-нуклеотидной области влево от сайта инициации (сайта кэпирозания) "проксимальный" цис-действующий сайт и два "дисталъных" сайта, которые играют важную роль при конститутивной экспрессии гена ТК и, вероятно, служат знаками пунктуации и являются участками связывания РНК-полимераз и вспомогательных факторов [338]. Цис-сайты со сходной функцией, необязательно идентичные по последовательности, по-видимому, присутствуют и в областях расположения других генов.

Синтез и процессинг герпесных белков

Герпесные белки синтезируются, по-видимому, и на свободных, и на связанных полисомах. Большинство белков, исследованных к настоящему времени, подвергается после синтеза интенсивному процессингу [27, 65, 88, 122, 230, 290]. Процессинг включает в себя разрывы цепи, фосфорилирование, сульфатирование, гликозилирование и т. п. Во многих случаях модификация структуры белка сопровождается переносом белка через мембраны [191]. Имеющиеся данные о процессинге белков и его связи с их функционированием будут подробно изложены в разделе, посвященном свойствам и функциям вирусных белков, а также в разделе, посвященном вирусным гликопротеинам.

Процессинг может идти не только потому, что он нужен вирусу, - он может быть обусловлен сходством вирусных белков с природными субстратами клеточных ферментов. Например, гликопротеины HSV-1 и HSV-2 в клетках африканских зеленых мартышек Vero расщепляются протеолитическим ферментом хозяина, тогда как в клетках НЕр-2 этого фермента или совсем нет, или он отщепляет меньший фрагмент, чем протеаза в клетках Vero [228, 229]. Хотя размножение вируса идет в клетках Vero не менее интенсивно, чем в клетках НЕр-2, было показано,. что протеолитический фермент в клетках Vero отщепляет эпитоп на поверхности гликопротеина В, связывающий одно из нейтрализующих моноклинальных антител [228, 229].

Свойства и функции герпесных белков

Идентификация новой функции, обнаруживаемой в зараженной вирусом клетке, или идентификация нового белка, выполняющего ту или иную функцию, обычно основана на сочетании биохимических и генетических методов. К сожалению, несмотря на объединенные усилия многих лабораторий, в настоящее время функции многих белков герпесвирусов остаются малоизученными.

Что касается альфа-белков, то условно-летальные мутанты найдены только по гену а4 [56, 156, 241, 245]. У HSV-1 белок а4 в денатурирующем полиакриламидном геле дает три полосы, обозначаемые 4а, 4Ь и 4с. В клетках, зараженных вирусом дикого типа, быстрее всех мигрирующий компонент 4а имеет кажущуюся мол. массу 160К и после импульсного радиоактивного мечения легко обнаруживается в цитоплазме [230, 328]. Это единственный компонент, который накапливается при непермиссивной температуре в клетках, зараженных некоторыми мутантами по гену а4 [158]. Два других компонента, присутствующие в полосах 4b и 4с, имеют кажущиеся мол. массы 163К и 170К и накапливаются в ядре [230, 328]. Накопление медленно мигрирующих компонентов совпадает по времени с транслокацией белка в ядро и включением; в белок добавленного в среду неорганического 32Р [69, 230]. Особенно интересно, что в ходе репродуктивного цикла импульсная метка 33Р может быть введена в состав а4-белков спустя заметное время после прекращения синтеза этих белков. Это свидетельствует об обмене фосфата между средой и белком в процессе заражения [328]. По данным Престона и Нотарианни [244], в изолированных ядрах а4 может подвергаться аденозилрибозилированию. Пока трудно оценить, какое это может иметь значение, поскольку неизвестно, протекает ли эта реакция при размножении вируса. Но именно таким аденозилрибозилированием можно объяснить включение в a4 добавленного в среду неорганического 32Р [230], следует отметить, что ассоциация и диссоциация фосфата с белком характерны для а4, а22 и а27 [328], но только для компонента 4с удалось наблюдать аденозилрибозилирование in vitro.

Есть сообщение, что а4 связывается с ДНК лишь в присутствии белков клетки-хозяина [75]. Хэй Р. и Хэй Дж. [101] наблюдали миграцию альфа-белков в ядро и их прочное связывание с клеточным хроматином.

Функции нескольких бета-белков связаны с синтезом вирусной ДНК. Белок бета8 имеет мол. массу - 120К- Он обладает сродством к одноцепочечной ДНК [248], причем связывание с ней носит кооперативный характер [269]. Мутанты с повреждениями в этом гене неспособны синтезировать вирусную ДНК при непермиссивной температуре [41, 91]. Среди других бета-белков следует назвать ТК [152], ДНК-полимеразу [239], ДНКазу [113, 146, 147, 206, 209, 242] и рибонуклеотидредуктазу [40, 126,. 127, 236].

Хотя все эти ферменты дублируют функции клеточных ферментов, по ряду свойств они отличаются от последних. Вирусная ТК, например, характеризуется намного более широким набором субстратов по сравнению с соответствующим клеточным ферментом. Хотя ТК рассматривается как пиримидиндезоксикиназа, в действительности она фосфорилирует и пуринпентозиды, и широкий набор нуклеозидных аналогов, которые клеточная киназа эффективно не фосфорилирует [132, 153, 155]. Эта особенность вирусной ТК послужила основой для широкого использования нуклеозидных аналогов при изучении экспериментальной и естественной герпетической инфекции. Присутствие гена ТК существенно для нормального размножения вируса при экспериментальной инфекции [72, 310], но не в клеточной культуре [152]. Это обстоятельство было использовано в ходе проводимого в последние годы изучения структуры генома HSV [235, 237, 238]. Мутанты с повреждениями в гене ТК подразделяются на несколько групп. Некоторые из них теряют способность синтезировать -функционирующую ТК, тогда как другие производят слишком малые количества фермента или производят фермент с более узкой субстратной специфичностью, который не фосфорилирует аналоги, используемые в целях отбора [50, 72, 240, 305]. Некоторые герпесвирусы (например, EBV, CMV) не имеют своей специфической ТК.

ДНК-полимер аз а и рибонуклеотидредуктаза тоже отличаются от соответствующих клеточных ферментов. ДНК-полимераза послужила объектом особенно многочисленных исследований вследствие ее необычайной чувствительности к ряду соединений, таких, как фосфоноацетат и фосфоноформиат. Описаны температурочувствительные мутанты HSV по ДНК-полимеразе [39, 250], некоторые из них устойчивы по отношению к ряду лекарственных препаратов, в том числе к фосфоноацетату [133, 249] и аналогам .нуклеозидов (например, ацикловиру) [46], ингибирующим вирусы дикого типа.

бета-полипептиды участвуют в отключении синтеза альфа-белков и клеточных белков и в индукции гамма-генов [118, 120].

Большинство идентифицированных к настоящему времени гамма-белков являются компонентами вириона: на долю гамма-белков приходится около половины известных продуктов генов HSV.

Структурные белки были идентифицированы как компоненты, выделяемые вместе с вирионами и капсидами. Однако определенно известна функция всего лишь нескольких структурных белков. Некоторые структурные белки, синтезируемые на поздних стадиях инфекции, функционируют на ранних стадиях; один или несколько из таких структурных белков способствуют освобождению вирусной ДНК из капсидов и прохождению ее через ядерные поры [12], участвуют в процессе отключения синтеза клеточных белков сразу после заражения [71, 253] и индуцируют экспрессию альфа-генов [11, 238].

Применение генетических методов для идентификации функции генных продуктов

Ключевым моментом в распознавании функций вируса герпеса и в определении расположения кодирующих их генов на генетических картах является использование температурочувствительных ts-мутантов. К настоящему времени идентифицировано более 30 комплементационных групп (см. [324]), - это уже само по себе выдающееся достижение, если учесть трудности отбора, тестирования и разнесения мутантов по комплементационным группам. ts-мутанты оказались необычайно полезны для картирования генов. Тем не менее этот подход к установлению вирусных функций и картированию соответствующих генов наталкивается на целый ряд трудностей.

Во-первых, многие вирусные гены, не играют существенной роли для размножения вируса в клеточной культуре в неселективных условиях. К ним относятся ген ТК, по крайней мере один из генов гликопротеинов (gC) и, возможно, ген компонента вириона, отвечающего за отключение клеточных синтезов. Несмотря на все попытки ввести условно-летальные мутации по альфа-генам, положительного результата удалось добиться только для гена a4. Это свидетельствует либо о том, что многие из этих генов несущественны для размножения вируса в клеточной культуре, либо о том, что участки генов, важные для их функции, очень малы. Менее правдоподобное объяснение заключается в том, что почти все мутации такого рода оказываются: безусловно-летальными. Как бы то ни было, выяснить функции этих генов путем конструирования условно-летальных мутантов не удалось.

Во-вторых, условно-летальные мутанты (например, ts-мутанты), полученные неспецифическими мутагенными воздействиями, часто содержат большое число молчащих нелетальных мутаций как по существенным, так и по несущественным генам. Это не вызывает особых проблем, если можно сопоставить функции гена, затронутого ts-мутацией при пермиссивных и непермиссивных температурах. Например, неспособность к синтезу вирусной ДНК при непермиссивной температуре легко обнаруживается даже в присутствии молчащих мутаций, которые меняют характер синтеза белков и при пермиссивных, и при непермиссивных температурах. Проблема становится намного более серьезной, хотя ее часто игнорируют, когда такое сопоставление оказывается невозможным: например, такие ситуации возникают, когда нужно проверить способность ts-мутантов к латентному существованию в геноме животного, температура тела которого непермиссивна для роста таких мутантов.

В-третьих, влияние побочных нелетальных мутаций можно в принципе устранить, если использовать сайт-специфический мутагенез. Так, одним из способов введения специфической мутации является трансфекция клеток интактной вирусной ДНК дикого типа вместе с фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген, в результате чего этот ген включается в геном потомства вируса. Известны случаи, когда геном вируса после такой трансфек-ции содержал ts-повреждения генов в отдаленных сайтах. Это свидетельствует о возможности рекомбинации введенных фрагментов с короткими, частично гомологичными нуклеотидными участками, в результате чего нуклеотидная последовательность в соответствующих сайтах изменяется. При этом возможно как возникновение, так и утрата мутации.

В-четвертых, возможность использования ts-мутантов частично зависит от эффективности их высевания при пермиссивных и непермиссивных температурах. Мутанты, дающие большую разницу в эффективности высевания вируса при пермиссивных и непермиссивных температурах, могут иметь несколько точечных мутаций. Хотя присутствие множественных мутаций в одном и том же гене не должно оказывать влияния на картирование гена .и идентификацию его функции, из-за него могут возникать трудности при картировании функциональных доменов генного продукта.

Пост и Ройзман [237] предложили способ, с помощью которого можно идентифицировать гены, не существенные для размножения вируса в клеточной культуре. Этот способ, основанный на использовании селективного маркера (например, ТК), заключается в следующем. Путем трансфекции клеток интактной ДНК дикого типа и фрагментом, содержащим делению по гену ТК, .авторы получали потомство вируса HSV-1 с делецией гена ТК (ТК). Далее, для проверки того, является ли какой-либо ген существенным для размножения в клеточной культуре, клетки трансфицировали геномной ДНК ТК-вируса и фрагментом, в котором в тестируемый ген вставлен нормальный ген ТК. Если потомство, отобранное по ТК+-фенотипу, несет вставленный ТК-фрагмент в соответствующей части вирусного генома, то это свидетельствует о том, что обрыв тестируемого гена не влечет за собой нарушения существенной функции. В качестве следующего этапа можно удалить весь этот ген или его часть путем совместной трансфекции клеток интактной ДНК, содержащей ТК-вставку, и фрагментом, содержащим делецию в исследуемом гене, с последующим отбором ТК-потомства. Таким способом сконструировали вирусы, содержащие делецию по гену а22 и провели отбор вирусов, лишенных внутренних инвертированных повторов, в состав которых входили гены а0 и а4 [235, 237]. Очевидно, эта процедура применима лишь к несущественным генам, которые не перекрываются с существенными.

Другой полезный прием заключается во введении в клетки экспрессируемых векторов, содержащих индивидуальные вирусные гены под контролем природных или искусственных промоторов. Примером служит ген ТК, который вводили под контролем собственного и под контролем множества других вирусных и клеточных промоторов [28, 166, 192, 327]. Помимо гена ТК HSV-1 существует ряд других легко экспрессируемых вирусных генов, которые можно вводить в клетки эукариот, в частности несколько генов гликопротеинов [22, 191, 272]. С помощью подобного рода экспрессируемых векторов, несущих в себе сигнал амплификации ДНК и энхансерные последовательности, усиливающие транскрипцию генов герпесвирусов, можно получить множество сведений о функциях вирусных генов и подготовить путь к конструированию стабильных мутантов, содержащих делеции специфических генов.

Регуляция экспрессии герпесных генов

Сложный характер размножения герпесвирусов и наблюдаемая наряду с этим воспроизводимость хода этого процесса навели на мысль о строгой регуляции всех происходящих при этом событий [256]. Механизм регуляции репликации вирусов остается интереснейшей областью исследований.

Регуляция экспрессии генов герпесвирусов работает по принципу каскада. В случае HSV он сводится к тому, что продукты альфа-генов вызывают индукцию бета-генов, продукты бета-генов выключают экспрессию альфа-генов и индуцируют экспрессию гамма-генов, а продукты гамма-генов выключают экспрессию бета-генов и сразу же вслед за началом нового раунда заражения индуцируют экспрессию альфа-генов [11, 12, 118, 120, 238]. Количество генных продуктов при этом регулируется независимо и процесс регуляции охватывает как транскрипционный, так и посттранскрипционный уровни.

Отдельные стороны регуляции репликации HSV могут служить ориентирами в изучении общих механизмов репликации:

1. Включение генов HSV содержит в себе три элемента: вирус-специфический транс-действующий сигнальный белок (или несколько белков); цис-действующие регуляторные и промоторные последовательности и ферменты, необходимые для осуществления транскрипции.

2. Транс-действующий фактор, необходимый для индукции альфа-генов, по-видимому, заложен в одном или нескольких структурных белках вируса. Этот вывод следует из того, что химерные гены, состоящие из структурной части гена ТК HSV-1, слитой с альфа-промоторными регуляторными областями HSV-1, после того как они встроены в геном клетки и придают ей ТК+-фенотип, индуцируются в условиях, которые препятствуют синтезу белков, кодируемых суперинфицирующим вирусом [11, 238]. Все альфа-гены содержат два набора общих последовательностей в регуляторных областях. Наибольшее внимание привлекают (гуанин+цитозин)-инвертированные повторы, рассеянные в виде многих копий возле гена а27 и выше сайта начала транскрипции альфа-генов [181]. В меньшем числе представлены относительно (аденин+тимин) -богатые последовательности, присутствующие в регуляторных областях альфа-генов в одной или нескольких копиях [181-183]. Последовательности, содержащие (А+Т)-богатый гомолог, наделяют конструкции из промотора и структурной части гена ТК способностью подвергаться регуляции подобно альфа-гену; (G+C) -богатые области определяют конститутивный уровень экспрессии генов. Природу и функцию транс-действующего сигнала, а также его способность к взаимодействию с регуляторной последовательностью и (или) с каким-либо клеточным фактором еще предстоит выяснить.

3. По крайней мере одним из транс-действующих белков, не обходимых для синтеза бета- и гамма-белков в ходе инфекции и для амплификации синтеза бета- и гемма-белков под контролем встроенных в клеточный геном вирусных генов, является белок а4. Это подтверждается хотя бы тем, что бета-гены, не экспрессируемые интактной ДНК при заражении в отсутствие функционирующего а4-белка [55, 157, 172, 241], в то же время экспрессируются, когда присутствуют в клетке в виде резидентных, или "временных" генов [238, 327]. Какая регуляция свойственна бета-генам: положительная, отрицательная или та и другая? Ответа на этот вопрос пока нет. Клетки, несущие резидентные бета-гены (например, ТК), обычно как раз и отбираются по экспрессии этих генов и поэтому могут быть использованы для отбора клеток, экспрессирующих бета-гены в отсутствие продукта гена а4. Белок а4 служит мощным индуктором, который может модифицировать продукты клеточных генов и взаимодействовать с регуляторными последовательностями ДНК, а в случае, когда наблюдается индукция ранних генов аденовируса, белок а4 выполняет функцию продукта аденовирусного гена Е1А. Это мнение вызывает возражение по следующим четырем причинам: ранние гены аденовируса могут экспрессироваться и в отсутствие продукта гена El А. [21, 212]; мутации по гену Е1А не являются условно-летальными в отличие от мутаций по гену а4 HSV [21, 137]; отсутствие специфичности индуцированных генов не воспроизводится в реципрокных экспериментах [11]; нет никаких убедительных объяснений тому, что продукты генов вируса герпеса индуцируют только гены, введенные в клетку путем трасфекции, и не индуцируют природные хромосомные гены. Очевидно, ответы на поставленные вопросы приблизят выяснение истинного механизма действия гена a4.

4. Пока мало данных о продукте транс-действующего гена, ни о цис-действующих последовательностях ДНК, вовлеченных в индукцию гамма-генов. Сообщалось, что химерные гены, полученные путем слияния регулятора гамма-1-5-промотора с геном ТК, на основе которых получена линия клеток с ТК+-фенотипом, ведут себя точно так же, как и истинные бета-гены [55]. В то же время вставка в ДНК HSV-1 гамма-2-промотора с 5'-конца в подходящей ориентации относительно структурной части гена ТК превращает этот ген в гамма-ген в том плане, что индукция ТК блокируется фосфоноацетатом - ингибитором синтеза вирусной ДНК. Индукция природной бета-ТК не ингибируется, а лишь усиливается фосфоноацетатом [170].

5. Данные о посттранскрипционном контроле основаны на сообщениях о регуляции процесса транспорта, вирусных транскриптов в цитоплазму [138, 139, 161]. Степень генетической сложности РНК, накапливающейся в ядрах клеток, зараженных HSV в присутствии циклогексимида и поддерживаемых в среде, содержащей циклогексимид, существенно выше, чем в цитоплазме.

6. Представления о регуляции на уровне трансляции основаны на нескольких опытах. Особо следует отметить, что и подавление синтеза белков хозяина структурными компонентами вириона сразу после заражения [70, 214, 253], и подавление синтеза продуктов альфа-генов появляющимися позднее вирусными факторами [69, 118] относятся к трансляционным событиям-они происходят даже при физической или химической энуклеации клеток. Важный факт установлен в работах Рида и Френкеля [253]: он заключается в том, что структурные компоненты вириона оказывают ингибирующее действие на синтез и клеточных, и альфа-белков, поскольку мутанты, вирионы которых неспособны отключать клеточные гены, образуют продукты альфа -генов в большем количестве, чем вирусы дикого типа. Высказано предположение, что мРНК генов, отключаемых по мере перехода от экспрессии альфа-генов к экспрессии бета- и далее гамма-генов, остаются связанными с полисомами.

Синтез вирусной ДНК, сборка и выход вируса из зараженной клетки

Репликация вирусной ДНК

Отличительной особенностью герпесвирусов, которой нет ни у каких других ядерных ДНК-содержащих вирусов, является необычно большое число кодируемых ими ферментов, вовлеченных в синтез молекулы ДНК. Хотя последовательность событий при репликации вирусной ДНК в общих чертах известна, многие детали этого процесса еще предстоит изучить. В клетках, зараженных HSV, синтез вирусной ДНК обнаруживается примерно через 3 ч после заражения и продолжается по меньшей мере 9-12 ч [263, 265]. ДНК синтезируется в ядре, но о кинетике синтеза ДНК судить трудно из-за возрастания пула дезоксинуклеозидтрифосфатов, достигающего насыщения на ранних стадиях заражения. Поэтому, если измерять скорость синтеза вирусной ДНК путем использования меченых дезоксинуклеозидов, она оказывается максимальной уже на относительно ранних стадиях инфекции,

В клетках, зараженных HSV-1, репликации лодвергается лишь небольшая часть всей ДНК родительского вируса. Радиоактивно-меченая ДНК не содержит свободных концов, т. е. она имеет либо кольцевую, либо конкатемерную ("голова-к-хвосту") форму [129, 130]. Меченые предшественники включаются в молекулы, осаждающиеся с большей скоростью, чем интактная двухцепочечная ДНК. В щелочном градиенте плотности сахарозы полосы меченой ДНК в основном обнаруживаются в позициях, характерных для небольших одноцепочечных фрагментов. Сразу же после начала синтеза вирусной ДНК в полосах, соответствующих по положению в градиенте вирусной ДНК, обнаруживается родительская ДНК, а также кольцевые и разветвленные линейные формы. Далее по ходу репродуктивного цикла эти формы ДНК сменяются крупными, быстро седиментирующими клубками ДНК- Имеющиеся данные указывают, что ДНК гер-песвирусов, по крайней мере на поздних стадиях: инфекции, реплицируется по механизму катящегося кольца [17, 129].

Первые данные о положении начальной точки репликации ДНК в геноме HSV были получены при изучении структуры дефектных геномов [80, 275]. Позднее в качестве начальных точек репликации стали рассматривать те последовательности, которые должны входить в состав фрагмента ДНК HSV и обеспечивать его амплификацию в пермиссивных клетках, подвергшихся трансфекции этим фрагментом вместе с интактной вирусной ДНК в роли помощника [201, 313]. Если принять это определение, то HSV-1 и, вероятно, HSV-2 содержат три начальные точки репликации ДНК. Две из них попадают в инвертированную с-последо-вательность S-компонента [8, 176, 201, 301, 302, 313], тогда как третья находится в середине L-компонента вблизи генов, кодирующих главный ДНК-связывающий белок (|38) и ДНК-полимеразу [78, 177, 289].

Секвенирование начала репликации S-компонента [210, 302, 320] свидетельствует о том, что все функции начала репликации сосредоточены в отрезке ДНК длиной 90 bр, в состав которого входит почти идеально палиндромная АТ-богатая последовательность длиной 45 bр. Поскольку участки начала репликации в составе S-компонента содержатся внутри повторов, можно ожидать, что они идентичны.

Относительно нуклеотидной последовательности начала репликации в составе L-компонента известно очень немного, однако никакой гомологии фрагментов, содержащих начальные точки репликации в S- и L-компонентах, не обнаружено. Практически ничего не известно о том, как функционируют эти участки. Особенно важно установить, функционируют ли какие-то из них или все они непосредственно в процессе репликации вирусной ДНК и насколько они эквивалентны или подчинены друг другу. В некоторых случаях петли в реплицирующейся ДНК HSV не совпадают с расположением начальных точек репликации [15]. Начальные точки репликации в составе S-компонента располагаются выше сайтов инициации транскрипции альфа-генов 4, 22 и 47 [1, 179, 322] и в то же время отличаются от главных последовательностей, регулирующих экспрессию этих генов [43, 181 - 183, 201].

Созревание (процессинг) ДНК и сборка вирионов

Сборка вирионов герпесвирусов состоит из следующих стадий.

1 стадия. Сборка пустых капсидов, накапливающихся в ядре.

2 стадия. Новосинтезированная вирусная ДНК процессируется и упаковывается в уже сформировавшиеся пустые капсиды. Созревание, или процессинг, включает в себя разрыв вирусной ДНК, не имевшей свободных концов, - кольцевой или конкатемерной; возможна также инверсия L- и S-компонентов (характерная для HSV). Для разрыва и упаковки ДНК необходима вирусная альфа -последовательность 176]; упаковывается правильно нарезанная ДНК, разрыв при нарезании прихоходится на альфа-последовательность и альфа-последовательность необходима для размножения дефектных геномов [302]. Согласно упрощенной модели, основанной на структуре концов ДНК HSV-1, разрыв молекул-предшественников с образованием нужных для упаковки фрагментов стандартной длины происходит во второй дистальной последовательности DR1 на конце S-компонента, причем эта последовательность DR1 - общая для двух соседних альфа -последовательностей [200].

3 стадия. Сформировавшиеся в ядре ДНК-содержащие капсиды прикрепляются к модифицированным внутренним ламеллам ядерной мембраны, из которых формируется оболочка вируса.

Относительно места, где вирионы герпесвирусов покрываются оболочкой, нет единого мнения. Почти все исследователи согласны, что начальная стадия этого процесса протекает на внутренних ламеллах. Вместе с тем многие авторы наблюдали капсиды на модифицированных участках цитоплазматических мембран в момент их одевания (или раздевания) и отсюда сделали вывод, что оболочка вируса формируется в цитоплазме.

Стэкпоул [298] выдвинул идею, согласно которой капсиды одеваются в оболочку на внутренних ламеллах, на внешних ламеллах выходят из оболочки и снова одеваются, когда попадают в эндоплазматический ретикулум; выход вируса в межклеточное пространство либо сопровождается новым одеванием вируса уже на плазматической мембране, либо представляет собой процесс слияния пузырьков, несущих в себе одетый в оболочку вирус, с плазматической мембраной. Большое число частиц, одеваемых в оболочку в цитоплазме,-достаточно серьезный факт, с которым нельзя не считаться. Следует отметить, что на тонких срезах формирование оболочки вокруг капсида на ядерной мембране наблюдается исключительно редко; видимо, процесс одевания капсида в оболочку протекает очень быстро. Поскольку каждый капсид, одевающийся в оболочку в цитоплазме, должен пройти через процесс одевания и раздевания в ходе переноса через ядерную мембрану, несовпадение числа капсидов, одеваемых в оболочку на ядерных и цитоплазматических мембранах, может объясняться либо тем, что скорость одевания капсида на ядерных мембранах много выше, чем на цитоплазматических, либо тем, что капсиды, скапливающиеся на цитоплазматических мембранах представляют собой капсиды, теряющие оболочку, или капсиды, одевание которых было прервано. Таким образом, принципиально важный вопрос о том, являются ли полуодетые цитоплазматические капсиды промежуточными продуктами процесса одевания или просто дефектными структурами, частично утратившими оболочку, пока остается без ответа. Интересно, что полуодетые цитоплазматические капсиды преобладают в линиях непрерывно делящихся клеток и сравнительно редки в первичных диплоидных клетках человека.

Выход вируса из клетки
В цитоплазме интактные одетые вирусные частицы обычно находятся в везикулах, окруженных мембранами [51, 123]. Это вполне естественно, поскольку структуры, окруженные слоем гликопротеинов, вряд ли могут быть стабильны в незащищенном виде в цитоплазме. На нескольких электронных микрофотографиях были видны трубчатые структуры; возможно, в некоторых клетках рассматриваемые структуры представляют собой цистерны цитоплазматического ретикулума, соединенные с плазматической мембраной [277]. Высказывалось предположение, что выход вируса из клетки идет по механизму, близкому к обратному фагоцитозу, - имеется в виду направление движения,,а не его механика. Как предполагают Джонсон и Спеар [134] на основании опытов с использованием монензина, вирионы секретируются через аппарат Гольджи, следуя по тому же пути, что и секретвруе-мые растворимые белки [135].

Роль вирусных гликопротеинов в процессах сборки, приобретения инфекционной активности и выхода вируса из зараженных клеток

В клетках, зараженных HSV, все идентифицированные к настоящему времени вирусные мембранные белки оказались гликозилированы. В то же время в клетках, зараженных EBV и другими герпесвирусами, найден негликозилированный мембранный белок.

Согласно имеющимся данным, биосинтез гликопротеинов герпесвирусов в общих чертах идет так же, как и биосинтез гликозилированных белков эукариотических клеток [34, 291]. Негликозилированные предшественники мембранных белков герпесвирусов синтезируются на полисомах, связанных с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Процесс гликозилирования включает в себя и трансляционные, и посттрансляционные модификации. Так, N-гликозилирование инициируется переносом ранее сформировавшихся гликанов (глюкоза-3-манноза-N-(ацетилглюкозамин)2) с долихолфосфатного липидного переносчика на остатки аспарагипа в составе последовательности Asn - X - Thr/Ser новосинтезированного полипептида (на месте X может стоять любая аминокислота) [173, 188, 309]. После этого олигосахаридные цепи по мере прохождения через аппарат Гольджи укорачиваются глюкозидазами, маннозидазами, что приводит к образованию полиманнозильных цепей, часто называемых высокоманнозными гликанами [125, 296]. Эти гликаны под действием гликозилтрансфераз чаще всего превращаются в гликаны сложного типа, содержащие пентасахаридный ствол (маннозаза)3- (N-ацетилглюкозамин)2] и ряд боковых ответвлений, имеющих состав: сиаловая кислота - галактоза - глюкозамин. Фукоза в тех случаях, когда она присутствует, присоединяется к уже сформированным цепям {124].

O-гликозилирование наблюдается реже [35, 134, 213, 220, 283]; оно инициируется переносом N-ацетилгалактозамина на гидроксильную группу треонина или серина, после чего в аппарате Гольджи добавляются еще галактозамин, N-ацетилглюкозамин, фукоза и сиаловая кислота [20]. Степень гликозилирования и конкретная структура сложных гликанов зависят от конформации белка вблизи сайта гликозилирования, поскольку от этого зависит доступность белка ферментам, участвующим в процессинге. Конформационными характеристиками белка может объясняться и гетерогенность гликанов, присоединенных к данному белку.

Информация о структуре гликанов HSV собрана в обзорах [34, 291]. Известно, что в составе гликопротеинов, кодируемых HSV-1, найдены и высокоманнозные N-связанные, и О-связанные, и сложные гетерогенные гликаны.

N-гликозилирование необходимо для инфекционности вируса. Это следует из того, что туникамицин, блокирующий N-гликозилирование, препятствует одеванию вируса в оболочку [225, 231, 232]. Превращение высокоманнозных гликанов в гликаны сложного типа необходимо для выхода вируса из зараженной клетки, но не для самой инфекционности [35, 134, 160, 279]. Индуцируемое HSV слияние клеток тоже требует условий, благоприятствующих формированию сложных гликанов, но в этом случае неясно, должны ли сложные гликаны входить в состав вирусных гликопротеинов, присутствовать на поверхности зараженных клеток или на поверхности как зараженных, так if тех незараженных клеток, с которыми сливаются зараженные при формировании поликариоцитов.

Судьба зараженной клетки

Клетки, продуктивно заражаемые герпесвирусами, не выживают. Почти с самого начала репродуктивного цикла зараженные клетки подвергаются крупным структурным и биохимическим изменениям, в конце концов приводящим к их разрушению.

Структурные изменения заражённой вирусом герпеса клетки.

Как описано в обзоре [262], самые ранние изменения происходят с ядрышком клетки; оно увеличивается в размере, смещается ближе к ядерной мембране и в конце концов распадается на фрагменты. Параллельно происходит маргинация клеточных хромосом, а на более поздних стадиях заражения наблюдаются искажение формы ядра и его сегментация. Такого рода искажения и появление разного рода "выростов" ранее ошибочно принимали за амитотическое деление [142, 278]. Маргинация хромосом не всегда сопровождается их разрывами, о которых сообщали многочисленные исследователи, но они возможны [262].

Для поздних стадий заражения характерно изменение вида, клеточных мембран, в особенности ядерных. На внутренней поверхности мембраны (обращенной к нуклеоплазме или цитоплазме, но не к просвету между внутренними и внешними ламеллами или к просвету цистерн эндоплазматического ретикулума) происходит накопление материала и формирование утолщений вдоль мембраны. В конце концов утолщенные участки ядерной мембраны сливаются и накладываются один на другой, создавая впечатление редупликации мембран.

Метаболизм клеточных макромолекул

Для клеток, зараженных герпесвирусами, характерно быстрое выключение метаболизма собственных макромолекул уже на ранней стадии заражения. Например, прекращается синтез клеточной ДНК, как это наблюдается при заражении вирусом псевдобешенства [18,144], HSV [5,263], EHV-1 [219] и EBV [86, 217]. Очень быстро падает также синтез клеточных белков-[265, 306, 307] и одновременно прекращается их гликозилирование[106, 109, 295].

Влияние заражения вирусом герпеса на метаболизм клеточной РНК представляется более разнообразным [262]. Спад синтеза РНК относится не ко всем видам РНК. Синтез 4S-PHK ингибируется сильнее, чем синтез РНК, более крупных чем 28S. Хотя синтез рибосомной РНК почти полностью подавляется, синтез и метилирование 45S-предшественника рибосомной РНК продолжается [317]. Синтез нерибосомных РНК тоже продолжается, но в синтезе белков эти РНК не используются [317].

Роль продуктов вирусных генов в подавлении метаболизма клеточных макромолекул

Имеющиеся данные, относящиеся к экспрессии клеточных функций в зараженной клетке, в основном касаются синтеза клеточных белков в клетках, зараженных HSV. Из этих данных следует, что отключение синтеза белков протекает по меньшей мере в две стадии.

Первая стадия протекает при участии структурных вирусных белков и не требует синтеза новых белков. Например, отключение синтеза клеточных белков при заражении HSV наблюдается в клетках, подвергшихся физической или химической энуклеации [69]; способность к -такому отключению сохраняется у вируса, очищенного в градиенте плотности, но утрачивается, если очищенный вирус подвергся тепловой инактивации или нейтрализации антителами. Отключение клеточного синтеза идет намного быстрее и эффективнее при заражении HSV-2 по сравнению с HSV-1; это побудило исследователей к поиску с помощью рекомбинантов HSV-1 XHSV-2 генетического локуса, обеспечивающего ускорение процесса отключения при заражении вирусом HSV-2 [71]. Вероятно, самым сильным свидетельством в пользу существования структурных компонентов, отключающих синтез клеточных белков, послужило выделение vhs-мутантов (от англ. virion host shutoff) HSV, неспособных отключать клеточный синтез полипептидов [253].

Вторая стадия наступает после того, как начинается синтез новых белков [69, 118, 120, 214, 216, 284]. Отключение клеточного синтеза совпадает по времени с синтезом (3-белков, но не исключена также возможность, что оно все же определяется продуктами гамма, а не бета-генов.

Механизм, с помощью которого HSV различает синтез вирусных и клеточных белков и отключает последний, неизвестен. Экспериментально доказано, что в клетках, трансформированных вирусом лейкоза после его индукции диметилсульфоксидом, деградация глобиновой мРНК сопряжена с синтезом белков HSV, тогда как распад клеточных полисом после заражения от него не зависит [214-216]. Рид и Френкель [253] предположили, что на ранних стадиях отключение синтеза белков компонентами вириона происходит без заметной дискриминации между синтезом вирусных и клеточных белков; они обнаружили, что в клетках, зараженных vhs-мутантами, синтез альфа-белков тоже усиливается. Это может означать, что на первой стадии действуют вирусные факторы, подавляющие синтез любых белков, и лишь на более поздней стадии появляются продукты вирусных генов, способные к дифференцированному подавлению синтеза клеточных, но не вирусных белков. Физиологическая роль ранней стадии подавления синтеза белков остается неясной; дело еще в том, что в природных условиях заражение клеток происходит при очень низком отношении числа вирусных частиц к числу клеток, тогда как для экспериментального изучения подавления вириона компонентами синтеза клеточных белков используют множественность заражения порядка >500 вирионов на клетку.

Вообще говоря, наблюдавшиеся до сих пор изменения клеточного метаболизма большей частью представляют собой крупные нарушения метаболизма макромолекул; возможно, что они отражают вызванные вирусом специфические изменения функции определенных макромолекул. Одним из них, возможно, является обусловленное вирусом усиление фосфорилирования одного из двух полипептидов, ассоциированных с малыми субчастицами рибосом [70, 149]. Сообщалось также, что один из стабильных клеточных белков с мол. массой ~ 130К после заражения теряет способность связываться с ДНК и что утрата этой способности сопряжена с действием поздних бета- или гамма- генов HSV [3]. Пока трудно сказать, какое значение могут иметь все эти наблюдения, но они открывают новые возможности для отбора мутантов, с помощью которых в дальнейшем может проясниться значение для репродукции вируса происходящих при заражении модификаций.

Вызванные вирусом изменения клеточных мембран

Первые подозрения о модификации герпесвирусами клеточных мембран возникли после того, как были обнаружены мутанты вируса В обезьяны, а также PSV и HSV, которые отличались от вирусов дикого типа по их воздействию на клетки. Если вирусы дикого типа обычно приводят к округлению и агрегации клеток, то мутантные вирусы вызывают слияние клеток в поликариоциты [255]. На основании этих наблюдений возникла идея о том, что герпесвирусы меняют структуру и антигенные свойства клеточных мембран; и действительно, в дальнейшем 'были получены прямые данные об изменении антигенной специфичности цитоплазматических и плазматических мембран зараженных клеток [263, 274] и о присутствии в них вирусных гликопротеинов [108, 109, 295].

Наши знания относительно созревания, метаболизма и функционирования вирусных гликопротеинов пока не позволяют судить о том, зачем нужно присутствие вирусных гликопротеинов на поверхности зараженной клетки; случайное ли это явление, обусловленное естественным перемещением связанных с мембранами белков, или это выработанная в ходе эволюции защита вируса от нейтрализации антителами при его переносе из клетки в клетку. Как бы то ни было, у зараженной клетки изменяется антигенная специфичность, и она становится мишенью для разрушающего действия иммунной системы.

Существует группа мутаций syn-, обусловливающих изменения в характере взаимодействия плазматических мембран зараженных клеток, что отражается на их "социальном поведении"; на генетических картах они оказались распределены по нескольким генетически независимым участкам генома HSV. Лишь одна из них локализована в области гена, кодирующего гликопротеин [186, 270], хотя можно полагать, что все они расположены в генах, кодирующих белки, способные связываться с мембранами. Множественность генетических локусов, мутации которых вызывают слияние зараженных клеток, может отражать то обстоятельство, что вирусные мембранные белки образуют многокомпонентные комплексы, и мутация, затрагивающая любой из компонентов комплекса, может изменять структуру и функцию всего комплекса в целом [270].

Важное значение могут иметь и вторичные проявления изменений в клеточных мембранах. В частности, в нескольких работах [141,317,335] сообщалось об утечке макромолекул из клеток после их заражения вирусами PSV и HSV. При изучении клеток, зараженных вирусом псевдобешенства [141, 335], было сделано заключение, что эта утечка вызвана продуктами вирусных генов, появляющимися через 4 ч после заражения. Повышенная утечка макромолекул должна сопровождаться изменением в распределении электролитов, а также проникновением в клетку молекул, для которых прежде она была непроницаема. Изменение в распределении электролитов должно отразиться на значении трансмембранного потенциала [83]. Возможность усиленного притока молекул извне была показана в опытах с использованием бензгидразона - ингибитора гликозилирования в клетках, зараженных HSV [312]. Действие ингибитора легко обнаруживается по тому, что в его присутствии мутанты syn- уже не вызывают слияния клеток. Пока найден лишь один мутант, устойчивый к этому ингибитору, причем эта устойчивость в одних клетках проявляется, а в других нет. Особенно обращают на себя внимание свойственные этому мутанту задержка или снижение скорости синтеза продуктов гамма-генов; это согласуется с гипотезой о том, что ингибитор проникает в клетки, зараженные чувствительным к нему вирусом, но при наличии мутаций, приводящих к задержке или снижению скорости синтеза мембранных белков, его приток в клетку оказывается затруднен и гликозилирование вирусных гликопротеинов идет обычным образом [312].

Замедление и последующее прекращение синтеза белков в зараженной клетке можно, по крайней мере частично, объяснить модификацией клеточных мембран, вызывающей утечку макромолекул и изменение концентрации электролитов. Однако, учитывая то обстоятельство, что изучение метаболизма макромолекул на ранних стадиях заражения обычно проводят в условиях, когда на клетку приходится более 500 вирионов и оболочки этих вирионов после проникновения вирусов оказываются в составе плазматической мембраны [221], встает вопрос, не связан ли дисбаланс электролитов с подобного рода сосредоточением вирусных оболочек в отдельных участках плазматической мембраны, и не этим ли объясняется подавление синтеза клеточных и вирусных белков, которое обычно приписывают действию компонентов вириона.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Anderson К. P., Costa R., Holland L., Wagner E. (1980). Characterization of HSV-1 RNA present in the absence of de novo protein synthesis, J. Virol.,34, 9-27.

2. Armstrong J. A., Pereira H. G., Andrewes С. И. (1961). Observations of the virus of infectious bovine rhinotracheitis and its affinity with the herpesvirus group, Virology, 14, 276-285.

3. Arsenakis M., Roizman B. (1984). A post a gene turns off the capacity of host protein to bind DNA in cells infected with herpes simplex virus I, J. Virol., 49, 813-818.

4. Asher Y., Heller M., Becker Y. (1969). Incorporation of lipids into herpes simplex virus particles, J. Gen. Virol., 4, 65-76.

5. Aurelian L., Roizman B. (1965). Abortive infection of canine cells by herpes simplex virus. II. The alternative suppression of synthesis of interferon and viral constituents, J. Mol. BioL, U, 539-548.

6. Bachenheimer S. L., Roizman B. (1972). Ribonucleic acid synthesis in cells infected with herpes simplex virus. VI. Polyadenylic acid sequences in viral messenger ribonucleic acid, J. Virol., 10, 875-879.

7. Barahona H. H., Melendez L. V., King N. W., Daniel M. D., Fraser C. E. O., Prevtlle A. E. (1973). Herpesvirus aotus type 2: A new viral agent from owl monkeys (Aotus trivirgatus), J. Infect. Dis., 127, 171 -178.

8. Barnett J. W., Eppstein D. A., Chan H. W. (1983). Class I defective herpes simplex virus DNA as a molecular cloning vehicle in eucaryotic cells, J. Virol., 48, 384-395.

9. Bartkoski M. J., Jr., Roizman B. (1976). RNA synthesis in cells infected with herpes simplex virus. XIII. Differences in the mcthylation patterns of viral RNA during the reproductive cycle, J. Virol., 20, 583-588.

10. Bartkoski M. J., Jr., Roizman B. (1978). Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. VII. Inhibition of internal melhylation of mRNA late in infection, Virology, 85, 146-156.

10. Batterson W., Roizman B. (1983). Characterization of the herpes simplex virion-associated factor responsible for the induction of a genes, J. Viral., 46,371-377.

11. Batterson W., Furlong D., Roizman B. (1983). Molecular genetics of herpes simplex virus. VII. Further characterization of a ts mutant defective in release of viral DNA and in other stages of viral reproductive cycle, J. VIrol., 45. 397-407.

12. Baucke R. В., Spear P. G. (1979). Membrane proteins specified by herpes simplex virus. V. Identification of an Fc-bmdmg glycoprotein, J. Virol., 32, 779-789.

13. Bayliss G. J., Marsden H. S., Hay J. (1975). Herpes simplex virus: DNA-binding proteins in infected cells and in the virus structure, Virology, 68, 124-134.

14. Becker Y., Dym H., Sarou I. (1968). Herpes simplex virus DNA, Virology, 36, 184-192.

15. Ben-Porat Т., Kaplan A. S. (1971). Phospholipid matabolism of hcrpesvirus-infected and uninfected rabbit kidney cells, Virology, 45, 252-264.

57. Ben-Porat Т., Tokazewski S. (1977). Replication of herpesvirus DNA. II. Sedimentation characteristics of newly synthesized DNA, Virology, 79, 292-301.

18. Ben-Porat Т., Rakusanova Т., Kaplan A. S. (1971). Early functions of the genome of herpes virus. II. Inhibition of the formation of cell-specific polysomes, Virology, 46, 890-899.

19. Ben-Porat Т., Veach R. A., Ihara S. (1983). Localization of the regions of homology between the genomes of herpes simplex virus type 1 and pseudorabies virus. Virology, 127, 194-204.

20. Berger E. C., Buddecke E., Kamerting J. P., Kobala A., Paulson J. C., Vliegenthart J. F. C. (1982). Structure, biosynthesis and functions of glycoprotein glycans, Experientia, 38, 1129-1162.

21. Berk A. J., Lee F., Harrison Т., Williams J., Sharp P. A. (1979). Pre-eariyadenovirus 5 gene product regulates synthesis of early viral messenger RNAs, Cell, 17, 935-944.

22. Berman P. W., Dowbenko D., Lasky L., Simonsen С. С. (1983). Detection of antibodies to herpes simplex virus with a continuous cell line expressing cloned glycoprotein D, Science, 222, 524-527.

23. Beyer T. A., Sadler J. E., Rearick J. L, Paulson. J. C., Hill R. L. (1981). Glycosyltransferases and their use in assessing oligosaccharide structure and structure-function relationship, Adv. Enzymol., 52, 123-175.

24. Biswal N., Murray B. K., Benyesh-Melnick M. (1974). Ribonucleotides in newly synthesized DNA of herpes simplex virus, Virology, 61, 87-99.

25. Braun D. K., Batterson W., Roizman B. (1984). Identification and genetic mapping of a herpes simplex virus capsid protein which binds DNA, J. Virol., 50, 645-648.

26. Braun D, K.., Roizman В., Pereira L. (1984). Characterization of posttranslational products of herpes simplex virus gene 35 proteins binding to the surface of full but not empty capsids, J. Virol, 49, 142-153.

27. Braun D., Pereira L., Norrild В., Roizman B. (1983). Application of denatu red, electrophoretically separated, and immobilized lysates of herpes simplex virus-infected cells for the detection of monoclonal antibodies and for studies of the properties of viral proteins, J. Virol., 46, 103-112.

28. Brinster R. L., Chen H. Y., Warren R., Sarthy A., Palmiter R. D. (1982). Regulation of metallothionein-thymidine kinase fusion plasmids injected into mouse eggs, Nature, 296, 39-42.

29. Buchman Т. G., Roizman В. (1978). Anatomy of bovine mammillitis DNA. I. Restriction endonuclease maps of four populations of molecules that differ in the relative orientation of their long and short components, J. Virol., 25, 395-407.

30. Buchman T. G., Roizman B. (1978)- Anatomy of bovine mammillitis DNA. II. Size and arrangements of the deoxynucleotide sequence, J. Virol., 27, 239-254.

31. Buchman T. G., Roizman В., Nahmias A. J. (1979). Exogenous genital rein fection with herpes simplex virus 2 demonstrated by restriction endonuclease fingerprinting of viral DNA, J. Infect. Dis., 140, 295-304.

32. Buchman T. G., Roizman В., Adams C., Stover H. (1978). Restriction endonuclease fingerprinting of herpes simplex DNA: A novel epidemiology tool applied to a nosocomial outbreak, J. Infect. Dis., 138, 488-498.

33. Buchman T. G., Simpson Т., Nosal C., Roizman В., Nahmias A. J. (1980). The structure of herpes simplex virus DNA and its application to molecular epidemiology, Ann. NY Acad. Sci., 354, 279-290.

34. Compadelli-Fiume G., Serafini-Cessi F. (1984), Processing of the oligosaccharide chains of herpes simplex virus type 1 glycoproteins. In: Herpesviruses, Vol. 3, ed. by B. Roizman, Plenum Press, New York.

35. Campadelli-Fiume G., Poletti L., Dall'Olio F., Serafini-Cessi F. (1982). Infectivity and glycoprotein processing of herpes simplex virus type 1 grown in a ricine-resistant cell line deficient in W-acetylglucosaminyl transferase L J. Virol., 43, 1061-1071.

36. Cassai E. A'., Sartniento M., Spear P. G. (1975). Comparison of the virion proteins specified by herpes simplex virus type 1 and 2, J. Virol., 16, 1327-1331.

37. Cebrian /., Bucchini D., Sheldrick P. (1983). Endless viral DNA in cells infected with channel catfish virus, J. Virol., 46, 405-412.

38. Cebrian J., Kaschka-Dierich C., Berthelot N., Sheldrick P. (1982). Inverted repeat nucleotide sequences in the genomes of Marek disease virus and the herpesvirus of the turkey, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 555-558.

39. Chartrand P., Crumpacker C. S., Schaffer P. A., Wilkie N. M. (1980). Physical and genetic analysis of the herpes simplex virus DNA polymerase locus, Virology, 103, 311-325.

40. Cohen J. C,, Henry B. E., Randall C. C. O'Callaghan D. J. (1977). Ribonucleotide reductase activity in hydroxyurea resistant herpesvirus replication, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 155, 395-399.

41. Conley A. F., Knipe D. M., Jones P. C., Roizman B. (1981). Molecular genetics of herpes simplex virus. VII. Characterization of a temperature-sensitive mutants produced by in vitro mutagenesis and defective in DNA synthesis and accumulation of 4 polypeptides, J. Virol., 37, 191-206.

42. Constanzo F., Campadelli-Fiume G., Foa-Tomas L., Cassai E. (1977). Evidence that herpes simplex virus DNA is transcribed by cellular RNA polymerase II. J. Virol., 21, 996-1001.

43. Cordingley M. G., Campbell M. E. M., Preston C. M. (1983). Functionalanalysis of a herpes simplex virus type 1 promoter: Identification of farupstream regulatory sequences, Nucleic Acids Res., 11, 2347-2365.

44. Costa R. H., Devi B. G., Anderson K. P., Gaylord B. H., Wagner E. K.(1981). Characterization of a major late herpes simplex-virus type 1 mRNA, J. Virol., 38, 483-496.

45. Courtney R. L, Powell K. L. (1975). Immunological and biochemical characterization of polypeptides induced by herpes simplex virus type 1 and 2. In: Oncogenesis and Herpesviruscs, Vol. II, ed. by G. dehe ct al., p. 63, International Agency for Research on Cancer, Lyon, France.

46. Crumpacker C. S., Chartrand P., Subak-Sharpe L H., Wilkie N. M. (1980). Resistance of herpes simplex virus to acycloguanosine-genetic and physicalanalysis, Virology, 105, 171-184.

47. Dales S., Chardonnet У. (1973). Early events in the interaction of adenoviruses with HeLa cells. IV. Association with raicrotubules and the nuclear pore complex during vectorial movement of the inoculum, Virology, 56, 465-483

48. Daniel M. D., Melendez L. V., King N. W., Barahona H. H., Fraser С. Е. 0., Garcia F. G., Silva D. (1973). Isolation and characterization of a new virus from owl monkeys: Herpesvirus aotus type 3, Am. J. Phys. Anthropol., 38, 497-500.

49. Daniel M. D., Melendez L. V., King N. W., Fraser C. E. O., Barahona H. H., Hung R. D., Garcia F. G. (1971). Herpesvirus aotus: A latent herpesvirus from owl monkeys (Aotus trivirgatus)-Isolation and characterization, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138, 835-845.

50. Darby G., Field H. Л, Salisbury S. A. (1981). Altered substrate specificity of herpes simplex virus thymidine kinase confers acyclovir resistance, Nature, 289, 81-83.

51. Darlington R. W., Moss L. H., Ill (1969). The envelope of herpesvirus, Proc. Med. Virol., 11, 16-45.

52. Davison, A. L, Wilkie N. M. (1981). Nucleotide sequences of the joint between the L and S segments of herpes simplex virus type 1 and 2, J. Gen. Virol., 55, 315-331.

53. Davison A. J., Wilkie N. M. (1983). Location and orientation of homologous sequences in the genomes of. five herpes viruses, J. Gen. Virol., 64, 1927-1941.

54. Delias H., Clements J. B. (1976). A partial denaturation map of herpes simplex virus type 1 DNA: Evidence for inversions of the unique DNA regions, J. Gen. Virol., 33, 125-133.

55. Dennis D., Smiley I. R. (1984). Transactivation of a late herpes simplex virus promoter, Mol. Cell. Biol., 4. 544-551.

56. Dixon R. A. F., Schaffer P. A. (1980). Fine structure mapping and functional analysis of temperature-sensitive mutants in the gene encoding the herpes simplex virus type 1 immediate early protein VP175, J. Virol., 36, 189-203.

57. Dolyniuk M., Pritchett R., Kieff E. (1976). Proteins of Epstein-Barr virus. I. Analysis of the polypeptides of purified enveloped Epstein-Barr virus, J. Virol., 17, 935-949.

58. Draper K. G., Frink R. J., Wagner E. K. (1982). Detailed characterization of an apparently unspliced |} herpes simplex virus type 1 gene mapping in the interior of another, J. Virol., 44, 1123-1128.

59. Dumas A. M., Geelen J. L. M. C., Marts W., Van der Noordaa J. (1980). Infectivity and molecular weight of varicella-zoster virus DNA, J. Gen. Virol., 47, 233-235.

60. Ebeling A., Keil G., Nowak В., Fleckenstein В., Berthelot N., Sheldrick P. (1983). Genome structure and virion polypeptides of the primate herpes virus- herpesvirus aotus type 1 and 3. Comparison with human cytomegalovirus, J. Virol., 45, 715-726.

61. Edson C. M. Thorley-Lawson D. A. (1983). Synthesis and processng of the three major envelope glycoproteins of Epstein-Barr virus, J. Virol., 46, 547-556.

62 Epstein M. A. (1962). Observations on the mode of release of herpes virus from injected HeLa cells, J. Cell. Biol., 12, 589-597.

63. Epstein M. A., Holt S. J. (1963). Adenosine triphosphatase activity at the surface of mature extracellular herpes virus, Nature, 198, 509-510.

64. Epstein M. A., Henle W., Achong B. G., Barr У. М. (1965). Morphological and biological studies on a virus in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma, J. Exp. Med., 121, 761-770.

65. Erickson J. S., Kaplan A. S. (1973). Synthesis of proteins in cells infected with herpesvirus. IX. Sulfated proteins, Virology, 55, 94-102.

66. Folk L., Deinhardt F,, Nonoyama M,, Wolfe L. G., Bergholz C., Lapin В.,Yakouleva L,, Agrba V., Hente G., Henle W. (1976). Properties of a baboon lymphotropic herpesvirus related to Epstein-Barr virus, Int. J. Cancer, 18, 798-807.

67. Falke D., Siegert R,, Vogell W. (1959). Elektronenmikroskopische Beiunde zur Frage der Doppelmembranbildimg des Herpes-simplex-virus, Arch. es. Virusforsch, 9, 484-496.

68. Feldman L. Т., Imperials M. J., Nevins J. R. (1982). Activation of early adenovirus transcription by the herpesvirus immediate early gene: Evidence for a common cellular control factor, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 79, 4952-4956.

69. Fenwick M., Roizman B. (1977). Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. VI. Synthesis and modification of viral polypeptides in enucleated cells, J. Virol., 22, 720-725.

70. Fenwick M. L., Walker M. f. (1978). Suppression of the synthesis of cellular macromolecules by herpes simplex virus, J. Gen. Virol., 41, 37-51.

71. Fenwick M., Morse L. S., Roizman B. (1979). Anatomy of herpes simplex virus DNA. XI. Apparent clustering of functions effecting rapid inhibition of host DNA and protein synthesis, J. Virol., 29, 825-827.

72. Field H. J., Wildy P. (1978). The patbogenicity of thymidine kinase-deficient mutants of herpes simplex virus in mice, J. Hyg. (Lond.), 81, 267-277.

73. Fleckenstein В., Bornkamm G. W.f Mulder C., Werner F.-J., Daniel M. D., Falk L, A,, Delius H. (1978). Herpesvirus ateles DNA and its homology with herpesvirus saimiri nucleic acid, J. Virol., 25, 361-373.

74. Fong C. K. Y., Tenser R. В., Hsiung G. D., Gross P. A. (1973). Ultrastructural studies of the envelopment and release of guinea pig herpes-like virus in cultured cells, Virology, 52, 468-477.

75. Freeman M. J., Powell K. L. (1982). DNA-binding properties of a herpes simplex virus immediate early protein, J. Virol., 44, 1084-1087.

76. Frenket N., Roizman B. (1972). Ribonucleic acid synthesis in cells infected with herpes simplex virus: Control of transcription and of RNA abundance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2654-2659.

77. Frenket N.. Roizman B. (1972). Separation of the herpesvirus deoxyribonucleic acid on sedimentation in alkaline gradients, J. Virol., 10, 565-572.

78. Frenkel N., Locker H., Vlazny D. A. (1980). Studies of defective herpes simplex viruses, Ann. NY Acad. Sci., 354, 347-370.

79. Frenkel N., Silverstein N. S., Cassai E., Roizman B, (1973). RNA synthesis in cells infected with herpes simplex virus. VII. Control of transcription and of transcript abundancies of unique and common sequences of herpes simplex 1 and 2, J. Virol., 11, 886-892.

80. Frenkel N., Locker H., Batterson W., Hayward G., Roizman B. (1976). Anatomy of herpes simplex DNA. VI. Defective DNA originates from the S component, J. Virol., 20, 527-531.

81. Friedman H. M., Cohen G. H., Eisenberg R. J., Seidel C. A., Cines D. B. (1984). Glycoprotein С of HSV-1 functions as a C3B receptor on infected endothelial cells, Nature, 309, 633-635.

82. Frink R. J., Anderson K. P., Wagner E. K. (1981). Herpes simplex virus type 1 HindlH fragment L encodes spliced and complementary mRNA species, J. Virol., 39, 559-572.

83. Fritz M. E., Nahmias A. J. (1972). Reversed polarity in transmembrane potentials of cells infected with herpesviruses, Proc. Soc. Exp. Bio!. Med., 139, 1159-1161.

84. Furlong D., Swift H,, Roizman B. (1972). Arrangement of herpesvirus deoxyribonucleic acid in the core, J. Virol., 10, 1071-1074.

85. Gerber P., Pritchett R. F., Kieff E D. (1976). Antigens and DNA of a chimpanzee agent related to Epstein-Barr virus, J. Virol., 19, 1090-1099.

86. Gergely L., Klein G., Ernberg I. (1971). Host cell macromolecular synthesis in cells containing EBV-induced early antigens. Studies by combined immunofluorescence and radioautography, Virology, 45, 2-29.

87. Gibbs E. P. J., Rweyemamu M. M. (1977). Bovine herpesviruses, Vet. Bull., 47, 417-425.

-88. Gibson W., Roizman B. (1972). Proteins specified by herpes simplex virus. VIII. Characterization and composition of multiple capsid forms of subtypes 1 and 2, J. Virol., 10, 1044-1052.

89. Gibson W., Roizman B. (1974). Proteins specified by herpes simplex virus. X. Staining and radiolabeling properties of B-capsid and virion proteins in polyacrylamide gels, J. Virol., 13, 155-165.

90. Given D., Kieff E. (1978). DNA of Epstein-Barr virus. IV. Linkage map of restriction endonuclease fragments of the B95-8 and W91 strains of Epstein-Barr virus, J. Virol., 28, 524-542.

91. Godowski P. J., Knipe D. M. (1983). Mutations in the major DNA-binding protein gene of herpes simplex virus type 1 results in increased levels of viral gene expression, J. Virol., 47, 478-486.

92. Goodheart C., Plummer G. (1974). The densities of herpes viral DNAs. In: Progress in Medical Virology, Vol. 19, ed. by J. L., Melnick, p. 324, S. Karger, Basel, Switzerland.

93. Grafstrom R. H., Alwine J. C, Steinhart W. L., Hilt C. W., Hyman R. W. (1975). The terminal repetition of herpes simplex virus DNA, Virology, 67,144-157.

94. Graham F. L., Velihaisen G., Wilkie N. M. (1973). Infectious herpesvirus DNA, Nature (Lond.), 245, 265-266.

95. Gravell M. (1971), Viruses and renal carcinoma of Rana pipiens. X. Comparison of herpes-type viruses associated with Lucke tumor-bearing frogs, Virology, 43, 730-733.

96. Green M. R., Treisman R., Maniatis T. (1983). Transcriptional activation of cloned human ^-globin genes by viral immediate early gene products, Cell, 35, 137-148.

97. Gruter W. (1924). Das Herpesvirus, seine aetiologische und klinische Bedeutung, Muench Med. Wochenschr., 71, 1058-1060.

98. Gustafsohn D. P. (1970). Pseudorabies. In: Diseases of Swine, 3rd ed., edited by H. W. Dunne, pp. 337-355, Iowa State University Press.

99. Hall L. M., Draper K. G., Fluck R. J., Carter R. H., Wagner E. K. (1982). Herpes simplex virus mRNA species mapping in EcoRI fragment I, J. Virol., 43, 594-607.

100. Hampariati V. V., Hllleman M. R., Ketler A. (1963). Contributions to characterization and classification of animal viruses, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 112, 1040-1052.

101. Hay R. T., Hay J. (1980). Properties of herpesvirusinduced "immediateearly" polypeptides. Virology, 104, 230-234.

102. Hay ward S. D., Lazarowitz S. G., Hayward G. S. (1982). Organization of the Epstein-Barr virus DNA molecule: II. Fine mapping of the boundaries of the internal repeat cluster of B95-8 and identification of additional small tandem repeats adjacent to the HR-1 deletion, J. Virol., 43, 201-213.

103. Hayward S. D., Nogee L., Hayward G. S. (1980). Organization of repeated regions within the Epstein-Barr virus DNA molecule, J. Virol., 33, 507-521.

104. Hayward G. S., Jacob R. J., Wadswortfi S. C., Roizman B. (1975). Anatomy of herpes simplex virus DNA: Evidence for four populations of molecules that differ in the relative orientations of their long and short segments, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 4243-4247.

105. Hayward G. S., Reyes G. R., Gavis E. R., McKnight S. L (1981). Identification, cloning, and sequencing of HSV thymidine kinase genes. In: Herpesvirus DNA: Developments in Molecular Virology, Vol. 1, ed. by Y. Beckerr pp. 271-306, Martinus, Nijhoff, Boston.

106. Heine J. W., Roizman B. (1973). Proteins specified by herpes simplex virus. IX. Contiguity of host and viral proteins in the plasma membrane of infected cells, J. Virol., 11, 810-813.

107. Heine J. W., Honess R. W.f Cassai E., Roizman B. (1974). Proteins specified by herpes simplex virus. XII. The virion polypeptides of type 1 strains, J. Virol., 14, 640-651.

108. Heine U. I. (1974). Intranuclear viruses. In: The Cell Nucleus, ed. By Busch, p. 489, Academic Press, New York.

109. Heller M., Dambaugh T., Kieff E. (1981). Epstein-Barr virus DNA- IX. Variation among viral DNAs from producer and nonproducer infected cells, J. Virol., 38, 632-648.

110. Heller M., Gerber P., Kieff E. (1982). DNA of lierpesvirus PAN, a third member of the Epstein-Barr virus-herpesvirus papio group, J. Virol., 41, 931-939.

111. Herz C., Roizman B. (1983). The a promoter regulator-ovalbumin chimeric gene resident in human cells is regulated like the authentic aA gene after infection with herpes simplex virus 1 mutants in cc4 gene, Cell, 33, 145-151.

112. fiirsch I., Vonka V. (1974). Ribonuclcotidcs liked to DNA of herpes simplex, type 1, J. Virol., 13, 1162-1168.

113. Hoffman P. /., Cheng Y. (1978). The deoxyribonuclease induced after infection of KB cells by herpes simplex virus type 1 or 2, J. Biol. Chem., 253,. 3557-3562.

114. Hoffman P. J., Cheng Y. (1979). DNAse induced after infection of KB ceilsby herpes simplex virus type 1 or type2, J. Virol., 32, 449-457.

115. Hoggan M. D., Roizman B. (1959). The isolation and properties of a variant of herpes simplex producing multinucleated giant cells in monolayer cultures in the presence of antibody, Am. J. Hyg., 70, 208-219.

116. Honess R. W., Roizman B. (1973). Proteins specified by herpes simplex virus. XI. Identification and relative molar rates of synthesis of structural and non-structural herpesvirus polypeptides in infected cells, J. Virol., 12, 1346-1365.

117. Honess R. W., Roizman B. (1974). The regulation of herpes simplex virus. protein synthesis. In: The Mechanisms of Virus Disease, ed. by W. S. Robinson and C. F. Fox, pp. 455-492, W. A. Benjamin, Menlo Park, Calif.

118. Honess R. W., Roizman B. (1974). Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three group of viral proteins, J. Virol., 14, 8-19.

119. Honess R. W., Roizman B. (1975). Proteins specified by herpes simplex-virus. XIII. Glycosylation of viral polypeptides, J. Virol., 16, 1308-1326.

120. Honess R. W., Roizman B. (1975). Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis: Sequential transition of polypeptide synthesis requires functional viral polypeptides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1276-1280.

121. Hones R, W., Watson D. H. (1977). Herpes simplex virus resistance and sensitivity to phosphonoacetic acid, J. Virol., 21, 584-600.

122. Hope R. G., Marsden H. S. (1983). Processing of glycoprotcins induced by herpes simplex virus type 1: Sulphation and nature of the oligosaccharide linkages, J. Gen. Virol., 64, 1943-1953.

123. Huang A. S., Wagner R, R, (1964). Penetration of herpes simplex virus into human epidermoid cells, Proc. Soc. Exp. Biol. Mcd., 116, 863-869.

124. Hubbard S. C,, Ivatt R. J, (1981). Synthesis and processing of asparagine-linked oligosaccharides, Annu. Rev. Biochem., 50, 555-583.

125. Hunt L. A., Etchison J. R., Summers D. F. (1978). Oligosaccharide chains are trimmed during synthesis of the envelope glycoprotein of vesicular stomatitis virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 754-758.

126. Huszar D., Bacchetti S. (1981). Partial purification and characterization of the ribonucleotide reductase induced by herpes simplex virus infection of mammalian cells, J. Virol., 37, 580-588.

127. Huszar D., Bacchetti S. (1983). Is ribonucleotide reductase the transfor ming function of herpes simplex virus 2? Nature, 302, 76-79.

128. lltis J. P., Oakes J. E., Hyman R. W., Rapp F. (1977). Comparison of the DNAs of varicella-zoster viruses isolated from clinical cases of varicella and herpes zoster, Virology, 82, 345-352.

129. Jacob R, J., Roizman B. (1977). Anatomy of herpes simplex virus DNA. VIII. Properties of the replicating DNA, J. Virol., 23, 394-411.

130. Jacob R, J., Morse L. S., Roizman B. (1979). Anatomy of herpes simplex virus DNA. XIII. Accumulation of head to tail concatemers in nuclei of infected cells and their role in the generation of the four isomeric arrange ments of viral DNA, J. Virol., 29, 448-457.

131. Jacquemont B., Roizman B. (1975). Ribonucleic acid synthesis in cells infected with herpes simplex virus: Characterization of viral high molecular weight nuclear RNA, J. Gen, Virol., 29, 155-165.

132. Jamieson A, T., Subak-Sharpe J. H. (1974). Biochemical studies on the herpes simplex virus-specified deoxypyrimidine kinase activity, J, Gen. Virol., 24, 481-492.

133. Jofre J. T., Schaffer P. A., Parris D. S. (1977). Genetics of resistance to phosphonoacetic acid in strain K.OS of herpes simplex type 1, J. Virol., 23, 833-836.

134. Johnson D. C., Spear P. Q. (1982). Monensin inhibits the processing of herpes simplex virus glycoproteins, their transport to the cell surface, and the egress of virions from infected cells, J. Virol., 43, 1102-1112.

135. Johnson D. C., Spear P. G. (1983). 0-Linked oligosaccharides are attached to herpes simplex virus glycoproteins in the gold! apparatus, Cell, 32, 987-997.

136. Johnson D. C., Spear P. G. (1984). Evidence for translational regulation of herpes simplex virus type I gD expression, J. Virol., 51, 389-394.

137. Jones N,, Shenk T. (1979). An adenovirus 5 early gene product funktion regulates expression of other early viral genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3665-3669.

138. Jones P., Roizman B. (1979). Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. IX. The transcription program consists of three phases during which both extent of transcription and accumulation of RNA in the cytoplasm are regulated, J. Virol., 31, 299-314.

139. Jones P. C., Hayward G. S., Roizman B. (1977). Anatomy of herpes simplex virus DNA. VI. a RNA is homologous to noncontiguous sites in both L and S components of viral DNA, J. Virol., 21, 268-276.

140. Jensson V., Wells A., Klin G. (1982). Receptors for the complement C3d component and the Epstein-Barr virus are quantitatively coexpressed on a series of B-cell lines and their derived somatic cell hybrids, Cell. Immunol., 72, 263-276.

141. Kamiya T., Ben-Porat T., Kaplan A. S. (1965). Control of certain aspects of the infective process by progeny viral DNA, Virology, 26, 577-589.

142. Kaplan A. S., Ben-Porat T. (1959). The effect of pseudorabies virus on the nucleic acid metabolism and on the nuclei of rabbit kidney cells, Virology, 8, 352-366.

143. Kaplan A. S., Ben-Porat T. (1960). The incorporation of CH-labeied nucleosides into rabbit kidney cells infected with pseudorabies virus, Virology, 11, 12-17.

144. Kaplan A. S., Ben-Porat T. (1963). The pattern of viral and cellular DNA synthesis in pseudorabies virus infected cells in the logarithmic phase of growth, Virology, 19, 205-214.

145. Kawamura H., King D. /., ^ndersora D. P. (1969). A herpesvirus isolated from kidney cell culture of normal turkeys, Avian Dis., 13, 853-863.

146. Keir H. M. (1968). Virus-induced enzymes in mammalian cells infected with DNA-viruses. In: The Molecula Biology of Viruses, ed. by L. V. Crawford and M. G. P. Stoker, pp. 67-99, Cambridge University Press, Cambridge.

147. Keir H. M., Gold E. (1963). Deoxyribonucleic acid nucleotidyltransferase and deoxyribonuclease from cultured cells infected with herpes simplex virus, Biochim. Biophys. Acta, 72, 263-276.

148. Keller J, M., Spear P. G., Roizman B. (1970). The proteins specified by herpes simplex virus. III. Viruses differing in their effects on the social behavior of infected cells specify different membrane glycoproteins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 65, 865-869.

149. Kennnedy I. M., Stevely W. S., Leader D. P. (1981). Phosphorylation of ribosomal proteins in hamster fibreblasts infected with pseudorabies virus or herpes simplex virus, J. Virol., 39, 359-366.

150. Kieff E. D., Bachenheimer S. L., Roizman B. (1971). Size, composition and structure of the DNA of subtypes 1 and 2 herpes simplex virus, J. Virol., 8,. 125-129.

151. Kieff E. D., Hoyer B., Bachenheimer S. L., Roizman B. (1972). Genetic relatedncss of type 1 and type 2 herpes simplex virus, J. Virol., 9, 738-745,

152. Kit S., Dubbs D. R. (1963). Acquisition of thymidine kinase activity by herpes simplex infected mouse fibroblast cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 11, 55-59.

153. Kit S., Dubbs D. R. (1965). Properties of deoxythymidine kinase partially purified from noninfected and virus-infected mouse fibroblast cell, Virology, 26, 16-27.

154. Klein G., Yefenof E., Falk K., Westmati A. (1978). Relationship between Epstein-Barr virus (EBV) production and the loss of the EBV receptor/complement receptor complex in a series of sublines derived from the same original Burkitt's lymphoma, Int. J. Cancer, 21, 552-560.

155. Klemperer H. G., Haynes G. R,, Sheddon W. I. H., Watson D. H. (1967). A virus-specific thymidine kinase in BHK 21 cells infected with herpes simplex virus, Virology, 3), 120-128.

[56. Knipe D. M., Ruyechan W. T., Roizman B. (1979). Molecular genetics of herpes simplex virus. III. Fine mapping of a genetic locus determining resistance to phosphonoacetate by two methods of marker transfer, J. Virol., 29, 698-704.

157. Knipe D, M., Ruyechan W. T., Honess R. W., Roizman B. (1979). Molecular genetics of herpes simplex virus. IV. The terminal a sequences of the L and S components are obligatorily identical and constitute a part of the structural gene mapping predominantly in the S component, Proc. Nat,..Acad. Sci. USA, 76, 4534-4538.

158. Knipe D. M., Ruyechan W. T., Roizman B., Halliburton L W. (1978). Molecular genetics of herpes simplex virus. Demonstration of regions of obligatory and non-obligatory identity in diploid regions of the genome by sequence replacement and insertion, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3896-3900.

159. Koide N,, Wells A., Volsky D., Shapiro /., Klein G. (1981). The detection of Epstein-Barr virus receptors utilizing radiolabelled virus, J. Gen. Virol., 54, 191-195.

160. Kousoulas K. G., Pellett P. E., Pereira L., Roizman B. (1984). Mutations affecting conformation or sequence of neutralizing epitopes identified by reactivity of viable plaques segregate from syn and is domains of HSV-l(F) gB gene, Virology, 135, 379-394.

161. Kozak M., Roizman B. (1974). Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis: Nuclear retention of non-translated viral RNA sequences Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 4322-4326.


Оценка: 7.61*8  Ваша оценка:

Популярное на LitNet.com М.Снежная "Академия Альдарил: роль для попаданки"(Любовное фэнтези) В.Соколов "Мажор 4: Спецназ навсегда"(Боевик) А.Ардова "Брак по-драконьи. Новый Год в академии магии"(Любовное фэнтези) А.Вильде "Эрион"(Постапокалипсис) Ю.Резник "Семь"(Антиутопия) Н.Любимка "Алая печать"(Боевое фэнтези) Н.Лакомка "Я (не) ведьма"(Любовное фэнтези) Е.Флат "В пламени льда"(Любовное фэнтези) А.Троицкая "Церребрум"(Антиутопия) Д.Сугралинов "Мета-Игра. Пробуждение"(ЛитРПГ)
Связаться с программистом сайта.

Новые книги авторов СИ, вышедшие из печати:
Д.Иванов "Волею богов" С.Бакшеев "В живых не оставлять" В.Алферов "Мгла над миром" В.Неклюдов "Спираль Фибоначчи.Вектор силы"

Как попасть в этoт список
Сайт - "Художники" .. || .. Доска об'явлений "Книги"