Олег Викторович Мосин: другие произведения.

К Вопросу Трансгенности Животных

Журнал "Самиздат": [Регистрация] [Найти] [Рейтинги] [Обсуждения] [Новинки] [Обзоры] [Помощь]
Peклaмa:
Конкурс "Мир боевых искусств. Wuxia" Переводы на Amazon!
Конкурсы романов на Author.Today
Конкурс Наследница на ПродаМан

Устали от серых будней?
[Создай аудиокнигу за 15 минут]
Диктор озвучит книги за 42 рубля
Peклaмa
 Ваша оценка:
  • Аннотация:
    Процесс клонирование животных клеток по своему механизму относится к генетической инженерии и заключается во включении чужеродных последовательностей ДНК или трансгенов в геном животного-реципиента с их последующей устойчивой наследуемостью в ряду последующих поколений. Трансгенез у животных довольно сложен и пока недостаточно изучен. Известно, например, что трансгены нередко экспрессируются, вызывая те или иные аномальные генетические структуры и функциональные изменения всего организма вплоть до генетических мутаций. Как сделать так, чтобы генетически сконструированный трансген обеспечил нормальное потомство? Об этом рассказывается в данной статье.

К ВОПРОСУ ТРАНСГЕННОСТИ ЖИВОТНЫХ

О.В. Мосин

Животная трансгенность означает включение чужеродных последовательностей ДНК или трансгенов в геном животного-реципиента с их последующей устойчивой наследуемостью в ряду последующих поколений. Процесс трансгенеза по своему механизму относится к генетической инженерии и, в частности, к генной и клеточной инженерии.

Сам процесс трансгенеза у животных довольно сложен. Доказано, что трансгены нередко экспрессируются, вызывая те или иные аномальные генетические структуры и функциональные изменения вплоть до изменения генетической "программы" развития всего организма и генетические мутации.

Подобного рода эксперименты обеспечивают заметный прогресс в области фундаментальных и прикладных разработок. К разряду фундаментальных также относят: анализ различных отклонений в экспрессии нормальных и мутировавших генов, включая онкогены; осуществление направленного мутагенеза за счет введения в животную клетку экспрессирующих специальных генно-инженерных конструкции, связанных с определенными генами и т. д.

К разряду прикладных исследований можно отнести, например, получение быстро растущих трансгенных свиней, выведение трансгенных овец, образующих и накапливающих в молочных железах некоторые факторы свертываемости крови человека и др.

Для получения трансгенных животных, в частности - мышей, можно воспользоваться такими методами, как микроинъекции ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо, заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, и, наконец, применение эмбриональных стволовых ES- или ЕК-клеток.

Рассмотрим каждый из вышеперечисленных методов в отдельности. Быстрота выполнения и надежность метода микроинъекций сделали его наиболее популярным среди биотехнологов специалистов-экспериментаторов. При этом используют различных линейных мышей, обеспеченных всем необходимым при хорошем их содержании в условиях вивария (животника). Обычно в опыт по микроинъекции берут не менее 20 гибридных самцов-производителей первого поколения (FI) в возрасте 8-12 месяцев, когда они характеризуются хорошей производительностью. При слабой или низкой активности самцов к подсаживаемым самкам их заменяют.

Донорами оплодотворенных яйцеклеток выступают не менее 10 неполовозрелых (12-14 г) гибридных самок первого поколения (FI), подвергшихся суперовуляции и спариванию с гибридными самцами FI. Оплодотворенные одноклеточные яйца выделяют из операционно вскрытых яйцеводов самок-доноров спустя 12 часов после их спаривания с самцами-производителями. Выделенные яйца помещают в культуру на срок от 3 до 36 часов. При этом от 10 самок можно получить 250 яиц, пригодных для микроинъекций.

Оплодотворенные яйцеклетки поддерживают на минеральной питательной среде М16 в микрокапельной культуре в СО2-инкубаторе тканей при 37?С и с 5% диоксида углерода.

Все другие манипуляции с яйцеклетками вне инкубатора проводят в HEPES-забуференной среде М2 (HEPES - это N-2-гидроксиэтилпиперазин - М-2-этансульфоновая кислота). Компонентный состав сред (кроме HEPES) почти тождественен. Различие касается лишь натрия бикарбоната, фенолового красного, натрия пирувата и кальция хлорида дигидрата, содержание которых в среде М16 больше, чем в среде М2. Остальные ингредиенты представлены KCL, NaCL, KH2PO4, MgSO 4 x 7Н2О, натрия лактатом, глюкозой, пенициллином, стрептомицином, бычьим сывороточным альбумином (БСА), внесёнными в дистиллированную воду.

Затем изолированные оперативным вмешательством яйцеклетки из яйцеводов выдерживают в атмосфере 5% СО2 при 37?С до микроинъекции в них клонированных ДНК любого размера в количестве 1-2 нл 0,0001-0,0005% раствора ДНК с помощью микроманипулятора.

Для трансплантации оплодотворенных яйцеклеток, в которые была инъецирована экзогенная ДНК, используют так называемых "суррогатных" матерей - псевдобеременных реципиентных самок (12 часов post coitum), вынашивающих такие яйцеклетки.

В целях получения псевдобеременных мышей половозрелые самки F-1 (19-20 г) в стадии эструса (течки, овуляции) спаривают со стерильными самцами, у которых операционно блокированы семявыносящие протоки.

Наилучшие результаты при этом получают с самцами линии Parkes, обладающих высокой половой активностью. Обычно используют 20-30 таких самцов, которых спаривают через день с названными выше самками (при этом получают в среднем 5 псевдобеременных самок в день). Псевдобеременные самки пригодны в последующем для пересадки донорских оплодотворенных яйцеклеток.

Затем отбирают те яйцеклетки, переживших микроинъекцию ДНК, и вводят их в специальную микропипетку, с помощью которой привносят в яйцевод псевдобеременной самки мыши оплодотворенную яйцеклетку с включенной в нее клонированной ДНК. Часть пересаженных яиц при этом погибает, а часть продолжает нормально развиваться.

После этого естественным путем (или с помощью кесарева сечения) получают трансгенное потомство, идентифицируемое с помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геномной ДНК, изолированной из хвоста (отрезают кончик хвоста длиной примерно 1 см).

При гомологии трансгена с каким-либо участком генома мыши используют блот-гибризацию, если же гомология незначительна или она отсутствует совсем, то ограничиваются дот-блот или слот-блот-анализом (от анг. blot - пятно, blotting - промокание, dot - точка, slot - прорез, паз). В первом случае, когда трансген идентичен эндогенному гену, он все равно окружен другими нуклеотидными последовательностями. Поэтому, используя рестриктазы, удается доказать локализацию трансгена в иных рестрикционных фрагментах.

Во втором случае, когда трансген негомологичен геному мыши, то он ограничен другими сайтами рестрикции, и здесь в качестве экспресс-метода удобен дот-блот или слот-блот-анализ. Фрагменты анализируемой геномной ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах выявляют при экспозиции с рентгеновской пленкой.

Трансгенные линии животных получают после скрещивания первичных трансгенных экземпляров.

Получение трансгенных животных [О.В.Мосин]

Другим методом получения трансгенных животных (в частности, мышей) является заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих целей.

Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные гены; ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственная копия ретровирусного генома ДНК прочно и строго определенным образом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экспрессии клонированных генов заметно повышается вследствие того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипционные энхасеры, или усилители. Известные ретровирусные векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей (MLV) или от вирусов птиц (ALV).

Геном ретровирусов функционирует по схеме:

РНК - обратная транскриптаза - ДНК - РНК - белок

Каждая вирусная частица содержит две копии одноцепочечного РНК-генома, а после проникновения в пермиссивную клетку этот геном переводится в линейную двухнитевую ДНК под влиянием вирусного фермента - обратной транскриптазы. Чтобы лучше и прочнее интегрироваться в клеточный геном клетки-мишени, линейная ДНК проникает в ядро клетке, где приобретает затем кольцевидную форму.

Интегрированная линейная ДНК-копия ретровирусного генома (провирус) имеет на обоих концах длинные нуклеотидные повторы - LTR (от англ, long termine repeats). 5'LTR несет промотор, с которого начинается транскрипция генов интегрированного провируса; 3' LTR-сайт полиаденилирования, где происходит терминация РНК-транскриптов.

Зарубежными учёными получен ряд векторов-экспрессии на основе ретровирусного генома. В простейших случаях в целях клонирования клеток животных, удаляют структурные гены и на их место встраивают один или больше рестрикционных сайтов. Из семейства векторов MLV известны: рМХ1И2, РМХ1122, рМХ262 и др. Ретровирусны вектор может включить лишь около 10000 полинуклеотидов. Имея в руках готовый вирусный вектор, им можно инфицировать подходящие клетки-мишени, например, фибробласты, экспрессиругощие соответствующие поверхностные рецепторы.

Чтобы заразить рекомбинантным ретровирусом эмбриональные клетки, в культуральную емкость с инфицированными фибробластами, продуцирующими рекомбинантный вирус, помещают восьмиклеточную морулу (группа бластомер, возникшая после равномерного дробления оплодотворенного яйца), освобожденную от яйцевой оболочки. Морула инфицируется и после достижения стадии бластоцисты ее вводят в матку псевдобеременной матери. Часть бластоцист может погибнуть, а часть нормально развивается и в соответствующие сроки трансформируется в трансгенное потомство, которое затем подвергается тщательному генетическому анализу и может использоваться для выведения трансгенных линий.

Бластоцисты стали родоначальницами плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток типов ES и ЕК. Показано, что, например, ES-клетки доступны культивированию in vitro и после каких-либо манипуляций (например, после введения клонированных генов путем инфекции или трансфекции) можно инъецировать их в бластоцисту и вернуть в живой макроорганизм. ES-клетки колонизируют эмбрион и составляют с ним единое целое, хотя колонизация ими зародышевого пути по разным причинам удается не всегда.

Последующие этапы работы с трансгенными животными во многом сходны с ранее описанными. Таким образом, все три метода получения трансгенных животных можно представить в виде схемы Д. Мерфи и Дж. Хенсону 1987 г.

С конца XIX века и до середины текущего столетия были разработаны методы пересадки эмбрионов от различных животных с последующим рождением полноценного потомства (клеточная инженерия).

Следовательно, получение популяции, состоящей из генетически идентичных особей (клонирование), возможно не только с помощью рассмотренных выше трех способов (микро-инъскций ДНК, вирусная инфекция и пересадка ES- и ЕК-клеток), но и с помощью пересадки эмбрионов, которая может быть осуществлена на различных представителях царства Animalia, например, на кроликах, козах, коровах, мышах, овцах и т.д. Так, для получения элитного стада коров в сравнительно короткий временной интервал (с учётом естественного процесса от зачатия до отела) отобранной родоначальнице вводят фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). В ответ на ФСГ её организм продуцирует 10-15 яйцеклеток вместо одной в норме. Все эти яйцеклетки оплодотворяются.

Через 4-5 дней, когда сформировавшиеся 32-клеточные эмбрионы (около 0,2 мм в диаметре) еще не прикрепились к стенкам матки и свободно плавают в ней, их вымывают, определяют полноценность и вводят микрошприцем непородистым коровам, находящимся в воспроизводительном цикле благодаря предварительному введению им простагландинов. Коровы-реципиенты эмбрионов вынашивают и рожают элитных телят в нормальные сроки.

Таким путем удается получить от одной элитной коровы в среднем 5 элитных телят за 15 месяцев. В этот срок с интервалом в 2-3 месяца у нее дважды забирают яйцеклетки и один раз она разрешается собственным теленком. На этом пути открываются заманчивые перспективы, связанные с возможностями оплодотворения яйцеклеток in vitro, а также длительным хранением эмбрионов в замороженном состоянии. Ведь тогда в целях экономии можно продавать такие эмбрионы в соответствующие агрохозяйства и звероводческие фермы.

С учетом религиозных воззрений, гражданских законодательств и этики в ряде стран решаются проблемы искусственного осеменения женских яйцеклеток зародышевыми клетками от мужчин. Лишь во Франции на начало 2002 года родилось свыше 10000 детей от женщин-доноров. Аналогичная процедура ныне широко практикуется во многих западных странах мира.

ЛИТЕРАТУРА

Биотехнология клеток животных. В 2-х томах. Под ред. Р. Е. Спиера и Дж. Гриффитса. М., ВО Агропромиздат, 1989.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса,

Блинов Н. П. Химическая микробиология. М., Высшая школа, 1989.

Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.

Иммунологические методы. Под. ред. Г. Фримеля. М., Медицина, 1987.

Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии. Минск, Высшая школа, 1986.

Н.П. Елинов. Основы биотехнологии. СПб. Наука. 1995.


 Ваша оценка:

Популярное на LitNet.com Д.Игнис "Безудержный ураган 2"(Уся (Wuxia)) В.Соколов "Мажор: Путёвка в спецназ"(Боевик) А.Кочеровский "Баланс Темного"(ЛитРПГ) К.Федоров "Имперское наследство. Сержант Десанта."(Боевая фантастика) С.Нарватова "4. Рыцарь в сияющих доспехах"(Научная фантастика) Е.Вострова "Канцелярия счастья: Академия Ненависти и Интриг"(Антиутопия) К.Федоров "Имперское наследство. Вольный стрелок"(Боевая фантастика) О.Бард "Разрушитель Небес и Миров. Арена"(Уся (Wuxia)) Е.Азарова "Его снежная ведьма"(Любовное фэнтези) А.Завадская "Архи-Vr"(Киберпанк)
Связаться с программистом сайта.

Новые книги авторов СИ, вышедшие из печати:
И.Мартин "Время.Ветер.Вода" А.Кейн, И.Саган "Дотянуться до престола" Э.Бланк "Атрионка.Сердце хамелеона" Д.Гельфер "Серые будни богов.Синтетические миры"

Как попасть в этoт список
Сайт - "Художники" .. || .. Доска об'явлений "Книги"