Одним .из интереснейших биологических феноменов является способность некоторых микроорганизмов расти в искусственных условиях на средах, в которых все атомы протия заменены на дейтерий (О.В. Мосин, Д.А. Складнев, В. И. Швец, 1996), хотя в природе этот изотоп составляет лишь 0,015%.

При попадании клеток в дейтерированную тяжёловодородную среду из них не только исчезает протонированная вода за счет реакции обмена Н2О-D2О, но и происходит быстрый H?D обмен в гидроксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех органических соединений, включая белки, нуклеиновые кислоты, липиды, сахара. Известно, что только С-Н-связь не подвергается обмену и соединения типа С-D синтезируются "de по-vo" (Чиргадзе с соавт., 1967). Интересно, что после обмена H?D ферменты не. прекращают своей функции (Themson et al., 1966; Денько, 1974), но изменения в результате изотопного замещения за счет первичного и вторичного изотопных эффектов (Thomson, 1963; Halevy, 1963), а также действие тяжёлой воды как растворителя (большая структурированность и вязкость по сравнению с обычной водой) приводят к изменению скоростей и специфичности ферментативных реакций. Изменения соотношения основных метаболитов в процессе адаптации к тяжеловодородной среде часто являются причинами гибели клеток. Так, например, клетки высших организмов погибают при содержании тяжёлой воды в составе тела свыше 30% (Денько, 1970), но микроорганизмы, легко приспосабливающиеся к резким изменениям среды обитания, способны жить и размножаться даже в 100%-ной тяжёлой воды (Мосин О.В, 1996). Давно замечено, что адаптация к тяжёлой воде проходит легче при постепенном увеличении содержания дейтерия в среде (Pratt a. Curry, 1938), так как чувствительность к тяжёлой воде разных ключевых систем различна. Способность к адаптации в высоких концентрациях тяжёлой воды связана с эволюционным уровнем организации, т. е. чем ниже уровень развития живого, тем выше способность к адаптации. Явление клеточной адаптации к тяжёлой воде интересно не только само по себе, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения ряда задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии.

Адаптация к тяжёлой воде является фенотипическим феноменом, поскольку адаптированные к тяжёлой воде клетки возвращаются к нормальному росту в протонированных средах после некоторого лаг-периода (О.В. Мосин с соавт., 1996). В то же время обратимость роста на D- и Н-средах не исключает возможности изменения метаболизма дейтерированных клеток, т.е. морфологической и функциональной перестройки в тяжёловодородной среде. С помощью, электронной микроскопии дейтерированных и обычных клеток микрококка (В. А. Ерёмин, Л. Н. Чекулаева, 1978) были выявлены существенные различия в морфологии полученных клеток (рисунок 1). Клетки, выращенные на Н- и D-средах, имели в 2-3 раза более толстую клеточную стенку; чем контрольные клетки, распределение в них нитей ДНК было неравномерным. На микрофотографии дейтерированных клеток хлореллы и микрококка видны как плотные (одинарная стрелка), так и электронно-прозрачные участки (двойная стрелка), последние, вероятно до приготовления срезов, состояли из плотно упакованных мембран, наподобие мезосом. Кроме того, для дейтерированного микрококка (рисунок 1, в) было также характерно резкое изменение формы клеток и направления их деления. При этом видно образование сложных структур, состоящих из 6-8 клеток. Наблюдавшееся деление не заканчивалось обычным расхождением дочерних клеток, а приводило к образованию атипичных клеток-"монстров", описанных Мозесом с соавт. (Moses et al., 1958).

Рис. 1. Электронные микрофотографии клеток бактерий M. Lysodeikticus; б - клетки, выращенные на протонированной среде, в - дейтерированные клетки, выращенные на тяжёловодородной среде (по данным В. А. Ерёмина и Л. Н. Чекулаевой, 1978 ).

По-видимому, наблюдаемые морфологические изменения связаны с торможением роста дейтерированных клеток и обусловлены перестройкой в процессе адаптации к тяжёлой воде. Тот факт, что дейтерированные клетки микрококка кажутся более крупными (кажущийся размер в 2-4 раза превосходит размер протонированных клеток), является общебиологическим, так как наблюдается при выращивании целого ряда животных и растительных
объектов (Денько; 1970).

Чтобы сделать более конкретные выводы о природе и механизмах адаптации клеток к тяжеловодородной среде, необходимы экспериментальные данные по физиологии "и биохимии адаптированных клеток. Однако не исключено, что торможение вех биологических функций (ферментативный катализ, дыхание, Деление) в момент клеточной адаптации к тяжёлой воде связано с образованием более стабильных связей, для разрыва которых требуется большая энергия. По теории абсолютных скоростей разрыв, СН-связей может происходить быстрее, чем CD-связей (Лазарева, 1973), подвижность D+ меньше, чем подвижность Н+, константа ионизации тяжёлой воды в 5 раз меньше константы ионизации обычной воды (Денько, 1970). Эти факты позволяют видеть некоторую аналогию между адаптацией к тяжёлой воде и адаптации к низким температурам. Ещё Юнг (Jung, 1967) на клетках Escherichia coli, помещенных в 98,6%-ную тяжёлую воду, показал, что эффект торможения роста тяжелой воды может быть компенсирован повышением температуры роста. Аналогия с охлаждением позволяет рассматривать адаптацию к тяжёлой воде, как адаптацию к неспецифическому фактору, действующему одновременно на функциональное состояние большого числа систем: превращение энергии, биосинтетические процессы, транспорт веществ, структуру и функции макромолекул. Возможно, что наиболее чувствительными к замене Н+ на D+ оказываются именно те системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва протонных связей. Такими системами в клетке могут быть дыхательная цепь и аппарат биосинтеза макромолекул, которые располагаются в цитоплазматической мембране или находятся под ее контролем.

Известно, что адаптация к тяжёлой воде происходит тем легче, чем медленнее повышается процентное содержание дейтерия в среде. Практически даже высокодейтерированные среды содержат протоны от 0,2-10%. Возможно, что остаточные протоны в момент адаптации к тяжёлой воде облегчают перестройку к изменившимся условиям, встраиваясь именно в те участки, которые наиболее чувствительны к замене. Если это так, то встраивание протонов должно приводить к накоплению легкого изотопа в органическом материале клеток и соответственно к обогащению тяжелым изотопом среды культивирования. Оказалось, что степень дейтерированности полученных клеток микрококка зависит как от исходного содержания протонов в тяжёлой воде, так и от степени дейтерированности клеток хлореллы. При выращивании клеток на тяжёловодородной среде, содержащей от б до 9% воды, клетки хлореллы имели показатель (Н) жирных кислот из D-липидов, равным 10-18%. D-клетки микрококка, выращенные на тяжёлой воде имели показатель (Н) 13,5-23%. При этом содержание протонов в средах при культивировании D-клеток хлореллы и микрококка уменьшалось, а в органическом материале выращенных клеток возрало (В. А. Ерёмин, Л.Н Чекулаева, 1978). На основании этого можно сделать вывод об избирательном поглощении протонов из высокодейтерированных сред в процессе адаптации и роста клеток хлореллы и микрококка. По-видимому, избирательное накопление легких изотопов в органическом материале клеток в процессе роста на среде с тяжелым изотопом является общебиологическим, так как наблюдается для широкого круга объектов (Денько, 1970) и для фракционирования легкого изотопа 12С в среде, содержащей 13С (Ивлев с соавт., 1975; Бондарь, 1976).

Рис. 2. Липидные профили протонированных (а) и дейтерированных (б) клеток Basilus subtilis; хроматограф Beckman Gold System (США), снабжённый насосом Model 166 (США) и детектором Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6 x 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ KH2PO4-ацетонитрил; 100% в течении 50 мин; скорость подачи: 0.5 мл/мин; детекция при 210 нм.

В клетках бактерий одним из важнейших инструментов регуляции метаболизма является мембрана, объединяющая в себе аппараты биосинтеза полисахаридов, трансформации энергии, снабжении клетки метаболитами и участвующая в биосинтезе белков, нуклеиновых кислот и липидов (Гельман с соавт., 1972; Коротяев, 1973; Островский, 1973). Можно предположить, что в адаптации к тяжёлой воде мембраны играют не последнюю роль. Однако до сих пор не понятно, что происходит с мембранами, как они реагируют на замену среды и какое это имеет значение для выживания клеток на среде, лишенной протонов. Структурно-динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава липидов, также могут изменяться в присутствии тяжёлой воды. Так, сравнительный анализ липидного состава дейтерированных клеток B. subtilis, полученных при росте на тяжёлой воде показал различия в количественном составе мембранных липидов по сравнению с обычной водой (рис. 4). Примечательно, что в образце полученном с тяжёлой воды соединения, имеющие времена удерживания - 33.38; 33.74 и 33.2 мин не детектируются (рисунок 2 б). Полученный результат, по видимому, объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, которая испытывает воздействие тяжёлой воды, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) изменением количественного состава липидов.

Выбор бактерий как объекта исследований представляется наиболее целесообразным, так как в этом случае способность адаптации к тяжёлой воде, обусловленная эволюционной "примитивностью", сочетается с относительной легкостью получения чистых мембран.

ЛИТЕРАТУРА

Гельман Н. С., Лукоянова М. А. и Островский Д. Н. 197(2. Мембраны бактерий и дыхательная цепь. "Наука", М.

Денько Е. И. 1970. Успехи соврем, биол., 70, 1(4), 41.

Ерёмин В. А., Чекулаева Л. Н. Выращивание бактерий Micrococcus Lysodeikticus на дейтерированной среде, Микробиология, 1978

Ивлев А. А., Королева М. Я. в Колошин А. Г. 1976. Мол. биол., 9, 3, 436.

Коротяев А. И. 1973. Механизмы саморегуляции бактериальной клетки. "Медицина", М.

Лазарева А. В. 1973. Избирательное изотопное замещение водорода на дейтерий в полипептидной цепи цитохрома С. Дисс. Ин-т биофизики АН СССР, Пущине.

Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. - 1993. - N 9. - С. 16-20.

Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 3. - С. 3-12.

Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. // Биоорганическая химия. - 1996. - Т. 22. - N 10-11. - С. 856-869.

Островский Д. Н. 1973. Строение, свойства и некоторые функции мембран бактериальной клетки. Дисс. Ин-т биохимии, М.

Семененйо В. Е. и Зверева М. Г. 1972. Физиол. растений, 19, 229.

Успенская В. И. 1966. Экология и физиология питания пресноводных водорослей. МГУ, М.