ЗАЩИТНЫЕ БЕЛКИ ИМУННОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА

Защитные белки - название в известной мере условное. В эту группу включены некоторые наиболее изученные белковые вещества, участвующие в проявлении защитных реакций организма. Основу их составляют белки иммунной системы (иммуноглобулину, антигены тканевой совместимости, интерлейкины, интерфероны и и др.). Целью этой лекции является рассмотрение наиболее хорошо изученных представителей этой группы белков.

Начать рассказ о защитных белках иммунной системы человека необходимо начать с иммунитета. Одним из условий существования живых организмов является наличие механизмов, позволяющих противостоять широкому воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе биологического происхождения. К таким факторам следует отнести прежде всего бактерии, вирусы и простейшие, являющиеся возбудителями инфекционных болезней. В процессе жизнедеятельности существуя также опасность возникновения и накопления нежелательных соматических мутаций (злокачественное перерождение и т. п.), что может приводить к гибели организма. Несмотря на существенные различия в происхождении этих факторов у них есть одна общая особенность - они генетически чужды организму. Именно эти особенности чужеродных факторов обусловила появление универсального, эволюционно сформировавшегося механизма защиты - иммунитета.

В этой связи следует упомянуть также о проблеме вакцин, т.е, об искусственном внесении чужеродных клеток или веществ (как правило, белковой или углеводной природы) с целью стимуляции защиты против организмов, построенных из аналогичных клеток или веществ. При этом в последние годы появились методы создания чисто искусственных вакцин, получаемых химическим синтезом.

Таким образом, иммунитет - это врожденная, наследуемая способности организма распознавать и обезвреживать чужеродный материал, поступивший извне или образовавшийся в результате патологического процесса.

Иммунная система человека и животных (позвоночных) высокоспециализирована и достаточно сложна. По своей значимости она сравнима с нервной системой. Основными органами иммунной системы человека являются костный мозг, лимфатические узлы, селезенка и тимус (зобная железа), которые связаны в функционально единое цепое системами лимфо- и кровообращения. Обший вес клеток иммунной системы человека - около 1 кг.

Главными клетками иммунной системы являются лимфоциты, число которых в организме человека превышает 1012. При этом существует два различных вида лимфоцитов, соответствующих , двум основным видам иммунного ответа: Т-лимфоциты, развивающиеся в тимусе и отвечающие за клеточный иммунитет, и В-лимфоциты, развитие которых не зависит от тимуса и которые отвечают за гуморальный (опосредуемый антителами) иммунитет.

Лимфоциты развиваются из стволовых клеток, дающих также начало всем остальным клеткам крови. Стволовые клетки локализованы у взрослых животных в костном мозге, а их последующая дифференцировка приводит к образованию В- и Т-клеток. Место дифференцировки В-лимфоцитов у млекопитающих не установлено; у птиц таким органом является сумка Фабрициуса (Bursa Fabricius), откуда и произошло название всей популяции. Образование Т-клеток из стволовых клеток происходит в тимусе. Затем В- и Т-лимфоциты мигрируют по лимфатическим сосудам в периферические органы иммунной системы - лимфатические узлы, селезенку и т.п., где они проходят заключительные стадии дифференцировки.

Окончательная дифференцировка лимфоидных клеток осуществляется под действием антигенов. Антиген - это любая молекула или система молекул (например, клетка), способная индуцировать иммунный ответ. В частности, под воздействием антигена В-клетка превращается в плазматическую клетку, являющуюся фабрикой по производству антител: плазматическая клетка секретирует антитела со скоростью около 2000 молекул в секунду. Плазматическая клетка не способна к дальнейшей дифференцировке и пролиферации и погибает через несколько дней. Продуцируемые ею антитела способны специфически реагировать с отдельными участками структуры антигена, так называемыми антигенными детерминантами или эпитопами, которых, как правило, у антигена множество.

Существуют три основные функционально различные популяции Т-клеток, образующиеся в результате антиген-не зависимой дифференцировки предшественников Т-лимфоцитов: а) цитотоксические Т-клетки (Т-киллеры), осуществляющие разрушение чужеродных или инфицированных вирусом собственных клеток организма; б) помогающие или индуцирующие Т-клетки (Т-хелперы), которые "помогают" специфическим Т- и В-клеткам отвечать на антиген, а также активируют макрофаги; в) подавляющие Т-клетки (Т-супрессоры), которые ингибируют ответ специфических Т- и В-лимфоцитов.

Развитие иммунной реакции организма на введение чужеродного антигена включает целый ряд этапов и межклеточных взаимодействий. Первоначальный контакт с антигеном, запускающий иммунный процесс, осуществляют макрофаги; при этом антиген попадает внутрь макрофага и претерпевает процессинг - расщепление гидролитическими ферментами с вычленением сравнительно небольших фрагментов, несущих отдельные антигенные детерминанты. Заключительным этапом процессинга является экспрессия (обратный транспорт) фрагментов на поверхность макрофага, где они оказываются в комплексе с собственными антигенами гисто-совместимости II класса; только в таком, а не в нативном виде антиген может продолжать цепь иммунных реакций, а именно активировать Т-хелперы. В свою очередь, Т-хелперы осуществляют развитие заключительных стадий процесса, способствуя образованию эффекторных клеток - Т-киллеров и плазматических клеток - из соответствующих клеток-предшественников. На всех этапах, требующих межклеточных взаимодействий, важную роль играют растворимые медиаторы иммунного ответа - лимфокины (белки лимфоцитар-ного происхождения) и монокины (белли, синтезируемые макрофагами): эти гормоноподобные белки, вырабатываемые различными популяциями клеток - участников иммунного ответа, вызывают последовательный рост клона и дифференцировку активированных антигеном лимфоцитов. С их помощью достигается амплификация (усиление) иммунного ответа, они же участвуют в последующей супрессии (остановке) иммунной реакции; последний процесс опосредуется Т-лимфоцитами-супрессорами. Известны и цитоток-сические лимфокины - лимфотоксин и фактор некроза опухолей, осуществляющие эффекторную функцию - лизис трансформированных клеток. Эффекторной системой, работающей на заключительном этапе иммунного ответа, является система комплемента, участвующая в деградации связанного с антителами антигена.

Таким образом, иммунная система представляет собой сложнейшую клеточную систему, в которой оперирует разветвленная сеть регуляторных механизмов, причем регуляция осуществляется как путем прямых межклеточных контактов, так и взаимодействий клетка - регуляторная молекула.

Наличие у большинства антигенов множества эпитопов (антигенных детерминант) приводит к активации большого числа клонов В-лимфоцитов, имеющих рецепторы соответствующей специфичности. В результате образующиеся плазматические клетки секретируют сложный набор антител, реагирующих с разными участками поверхности антигена, т. е. наблюдается поликлональный ответ. Получить обычной иммунизацией антитела к заданной детерминанте очень сложно.

В настоящее время эту задачу удается решить с помощью так называемой гибридомной технологии, разработанной в середине 70-х годов Дж. Кёлером и Ц. Мильштейном. Гибридомная технология основана на слиянии соматических клеток и заключается в гибридизации иммунных В-лимфоцитов с опухолевыми клетками (рис. 1).

Клетки лимфоузла (чаще всего селезенки), иммунизированного определенным антигеном животного, сливаются в присутствии полиэтиленгликоля с миеломными клетками. Такая гибридизация приводит к образованию клеток, унаследовавших от одной из родительских клеток (плазматической клетки) способность секретировать антитела, а от другой (миеломной) - способность к бесконечному делению. Ключевым моментом является отбор гибридных клеток, отделение от родительских клеток. Одна из популяций таких клеток - плазмациты - отмирает без каких-либо дополнительных воздействий в процессе культивирования клеток после слияния (как уже говорилось выше, плазмациты - короткоживущая клеточная популяция). Для того чтобы избавиться от родительских опухолевых клеток, используются мутантные миеломные клетки, дефицитные по двум ферментам - гипоксантин-фосфорибозилтрансферазе (ГФТ) и тимидинкиназе (ТК),- ответственным за запасной путь биосинтеза нуклеиновых кислот (использующий гипоксантин/ гуанин и тимидин). Если блокировать и основной путь биосинтеза пуринов и пиримидинов с помощью аминоптерина, то такие мутанты оказываются нежизнеспособными и погибают. Гибридные же клетки, имеющие от второй родительской клетки гены ГФТ и ТК, способны к размножению в присутствии аминоптерина; таким образом, культивируя клетки после слияния на селективной среде (содержащей аминоптерин), удается добиться избирательного роста популяции гибридных клеток. Рассеивая гибридные клетки по лункам иммунологического планшета, добиваются того, чтобы в лунке оказался лишь один клеточный клон, отбираются клоны, секретирующие антитела нужной специфичности (для чего проверяется наличие соответствующих антител в культуральной среде), а затем наращиваются гибридные клетки в больших количествах in vitro или in vivo в виде асцитов у животных. Такая технология позволяет нарабатывать значительные количества так называемых моноклональных (продуктов одного клона) гомогенных антител. В большинстве случаев моноклональные антитела получются на мышах, реже на крысах. Получение человеческих моноклональных знтител встречает серьезные методические затруднения, прежде всего из-за малодоступности иммунных лимфоцитов человека.

Что же такое антитело? Антитело - класс белков, продуцируемых В-лимфоцитами и осуществляющих первый этап в цепи превращений антигена - его связывание. Уникальным свойством антител является то, что они существуют в виде миллионов различных видов, каждый из которых имеет свой специфический участок связывания антигена. Обобщенно обозначаемые как иммуноглобулины (сокращенно Ig), антитела представляют один из основных классов белков крови, составляя около 20% от общего веса белков плазмы (общее число молекул антител в организме человека равно 1020).

Молекула антитела состоит из четырех полипептидных цепей: двух легких (L) цепей и двух тяжелых (Н) цепей. Четыре цепи удерживаются вместе с помощью нековалентных взаимодействий и S-S-связей. В результате ограниченного протеолиза папаином (Р. Портер, 1959) молекула иммуноглобулина расщепляется примерно в середине Н-цепей на два идентичных Fab-фрагмента, каждый с одним антиген связывающим центром, и один Fc-фрагмент (рис.2).

Таким образом, молекула антитела имеет Y-образную форму с двумя идентичными антигенсвязывающими центрами - по одному на каждом крыле. Благодаря такой структуре антитела могут "сшивать" молекулы антигенов, имеющие две или несколько антигенных детерминант, в большие частицы - агрегаты (рис. 3), которые после достижения определенных размеров могут выпадать в осадок из раствора.

Успехи, достигнутые в изучении структуры иммуноглобулинов, оказались возможными благодаря установлению того факта, что каждый вид антител продуцируется отдельной популяцией клеток (клоном). Присутствующие в крови нормальных индивидов антитела являются продуктами секреции множества клонов и представляют собой сложнейшую смесь близких по структуре, но не идентичных белков. В связи с этим в качестве материала для исследования в настоящее время используются иммуноглобулины пациентов, страдающих множественной миеломой - заболеванием, при котором трансформированные клетки выделяют в кровь огромные количества иммуноглобулинов (так называемые миеломные белки), Эти "патологические" иммуноглобулины по структуре и биологическим свойствам являются "нормальными" иммуноглобулинами, однако секретируются одним клеточным клоном и поэтому гомогенны.

Исследование первичной структуры миеломных белков было проведено в конце 60-х годов в лабораториях Р. Портера в Оксфорде и Дж. Эдельмана в Нью-Йорке. Характерной чертой строения молекул иммуноглобулинов является так называемая доменная структура. И легкие и тяжелые цепи упакованы в компактные домены, состоящие примерно из 110 аминокислотных остатков и содержащие внутримолекулярные дисульфидные связи. Легкие (каждая содержит около 220 аминокислот) и тяжелые (каждая содержит около 440 аминокислот) цепи антител имеют по две резко различающихся области: вариабельную (V), локализованную в N-концевой части полипептидной цепи, и следующую за ней константную (С). Цепи иммуноглобулинов данного класса различаются только по аминокислотным последовательностям V-областей и имеют практически идентичные С-области. Такая необычная для белков структура связана со свойствами этих систем. В самом деле, функции антител состоят, с одной стороны, во взаимодействии с антигенами, и в этом отношении они должны быть высокоспецифичными, а с другой стороны, самые разные по специфичности антитела должны обладать рядом общих свойств: связывать комплемент, фиксироваться на мембранах, взаимодействовать с некоторыми клетками и т. п. Поэтому вариабельность структуры V-областей обусловливает специфические свойства молекулы, тогда как структура константной области молекулы обеспечивает реализацию ряда общих свойств.

Вариабельные участки (VL) - (VH) представляют собой единичные домены (рис. 4).

Аминокислотные замены, обусловливающие структурные отличия, обычно группируются в нескольких так называемых гипервариабельных участках. В нативной молекуле иммуноглобулина V-области легкой и тяжелой цепи соединены так, что их гипервариабельные участки образуют единый активный центр. В настоящее время установлено, что антигенсвязывающий участок образован 20 - 30 аминокислотными остатками вариабельной части каждой цепи.

С-Область легкой цепи также представлена одним доменом (CL), тогда как у тяжелых цепей она заметно длиннее и состоит из 3 - 4 линейно расположенных доменов (СН1 - СН3), структурно гомологичных С-области легкой цепи. Каждый домен упаковывается в отдельную относительно независимую глобулу, причем основной тип вторичной структуры глобулы - антипараллельная складчатая (рис. 5). Между глобулами находятся открытые участки полипептидной цепи, особенно чувствительные к действию протеолитических ферментов. Весьма вероятно, что именно эти участки цепи обеспечивают значительную гибкость всей структуры, позволяющей молекуле антитела приспособиться к конфигурации антигена или взаимодействовать с двумя антигенными детерминантами, расстояние между которыми может варьировать.

У позвоночных существует 5 различных классов антител: IgG (мол. масса 150 000), IgM (950 000), IgA (500 000), IgD (175 000) и IgE (200000), каждый со своим собственным типом тяжелых цепей - альфа, бета, гамма, тетра , эпсилон соответственно.

Иммуноглобулины IgG являются основным классом иммуноглобулинов крови. В отличие от них, IgM-белки представляют собой класс антител, продуцируемых В-клетками первыми в процессе развития иммунного ответа. Непосредственные предшественники В-клеток, так называемые пре-В-клетки, синтезируют только мю-цепи, которые накапливаются внутри клеток. Когда пре-В-клетки начинают синтезировать также и легкие цепи, они соединяются с мю-цепями и образуют молекулы IgM, которые встраиваются в плазматическую мембрану, где выступают в качестве антигенраспознающего рецептора. С этого времени клетки становятся зрелыми В-лимфоцитами и могут отвечать на антигенный стимул. Хотя все классы антител могут существовать в мембрано-связанном виде (в качестве антигенспецифических рецепторов клеточной поверхности) или в форме водорастворимых секретируемых молекул, IgM являются основным классом антител, обнаруженным на поверхности большинства В-клеток. В секретируемой форме IgM-белки представляют собой пентамеры, построенные из 5 мономерных иммуноглобулинов, и имеют 10 антигенсвязывающих центров. Кроме того, каждый пентамер содержит одну копию полипептида, названного J-цепью (20 000), который синтезируется антителообра-зующей клеткой и ковалентно встраивается между двумя соседними Fc-областями.

Иммуноглобулины IgA являются основным классом антител в секретах (молоке, слизи, слезах, секретах дыхательных путей и кишечника). Эти белки существуют либо в виде мономера (как IgG), либо чаще в виде димера, содержащего дополнительно одну J-цепь и еще одну полипептидную цепь, называемую секреторным компонентом. Секреторный компонент синтезируется эпителиальными клетками и первоначально находится на внешней поверхности этих клеток, где он служит в качестве рецептора для связывания IgA из крови. Образующийся комплекс (IgA - секреторный компонент) поглощается клетками путем эндоцитоза, переносится через цитоплазму эпителиальных клеток и выделяется в секреты. Дополнительно к этой транспортной роли секреторный компонент может также предохранять молекулу IgA от деградации протеолитическими ферментами в секретах.

Иммуноглобулины IgD и IgE являются минорными компонентами сыворотки крови - их концентрация не превышает 0,3 мг/мл и 0,0001 мг/мл соответственно. Белки типа IgD выполняют функцию рецепторов и имеют высокий процент связанных сахаров; их роль окончательно не выяснена. Иммуноглобулины IgE, осуществляющие в норме защиту от паразитарных инфекций, обусловливают многие аллергические реакции. Они связываются с высоким сродством с поверхностью тучных клеток, и присоединение к ним антигена вызывает дегрануляцию и выброс в кровь биоактивных аминов, прежде всего гистамина и серотонина.

Наряду с пятью классами тяжелых цепей, высшие позвоночные имеют два типа L-цепей, а именно каппа и лямбда, каждая из которых может быть ассоциирована с любой из Н-цепей. Индивидуальная молекула антитела всегда состоит из идентичных L-цепей и идентичных Н-цепей, благодаря чему ее антигенсвязывающие центры всегда одинаковы.

Установленно, что организм животного может синтезировать от 106 до 109 различных молекул антител. Этот набор, по-видимому, достаточен для того, чтобы для любой антигенной детерминанты нашелся соответствующий антигенсвязывающий центр. Поскольку антитела являются белками, а их структура кодируется генами, встает вопрос о том, каким образом такое громадное количество различных антител может кодироваться в геноме. В 1965 г. В. Дрейером и Ж. Беннетом была сформулирована гипотеза, впоследствии блестяще подтвердившаяся, что вариабельные и константные участки цепей иммуноглобулинов кодируются разными генами. Все гены вариабельных участков расположены кластером в одной области генома, а гены константных участков - в другой, далеко отстоящей от первой. Выяснилось также, что имеются еще две группы генов J и D (для тяжелых цепей), кодирующие небольшие участки (несколько аминокислот) полипептидной цепи иммуноглобулинов, лежащие между V- и С-областями. В таком виде гены находятся в зародышевой ДНК; в процессе дифференцировки В-лимфоцитов начинается перегруппировка генома. Первоначально, в процессе превращения клетки-предшественника в пре-В-лимфоцит, происходит перемещение определенного VH- гена к JH-и D-гену с образованием генного сегмента vh-D-JH- Этот сегмент транскрибируется с находящимся теперь по соседству Си-геном, в результате чего пре-В-лимфоциты синтезируют jA-цепи. В зрелом В-лимфо-ците может происходить еще одна транспозиция, и VH-D-JH присоединяется к какому-либо другому Сн-гену, приводя к экспрессии иммуноглобулина другого класса. В дальнейшем, в процессе транскрипции ДНК, а затем созревания мРНК из гена вырезаются лишние участки, после чего V-, D-, J-, и Н-гены оказываются соединенными в непрерывную последовательность, которая и транслируется. Аналогичным образом собирается ген легкой цепи, который кодируется своими VL- и С L-генами.

В геноме имеется множество V-генов, некоторое количество J- и D-генов и по одному гену каждого субкласса тяжелых цепей. Как следствие такого не совсем обычного способа кодирования иммуноглобулиновых молекул возникает возможность появления громадного разнообразия антител с различающимся строением и свойствами. Действительно, в результате перестройки генома получаются всевозможные комбинации указанных генов, что приводит к созданию молекул, каждая из которых обладает уникальной структурой.

Изучение строения генов константных областей тяжелых цепей иммуноглобулинов показывает, что они состоят из ряда экзонов, каждый из которых кодирует отдельный домен молекулы. Принимая во внимание тот факт, что каждый из V-генов и Сl-генов кодирует один домен, а также структурную гомологию между доменами, можно предположить, что все они возникли в процессе эволюции путем серии дупликаций генов, начиная с предкового гена, кодирующего белок размером ПО аминокислот.

На основании рентгеноструктурного анализа выяснено пространственное строение как целой молекулы IgG, так и ее фрагментов (А. Эдмонсон, 1973). Установлено, что все домены иммуноглобулинов имеют очень похожую трехмерную структуру, получившую название иммуноглобулиповой упаковки (рис. 6).

Каждый домен похож на "сэндвич", образованный двумя слоями белка: один слой содержит три витка полипептидной цепи, а другой - четыре. В каждом слое соседние витки являются антипараллельными и образуют бета-структуру. Два слоя располагаются примерно параллельно друг другу и соединяются одной внутрицепочечной S-S-связью.

Структура вариабельных доменов такова, что гипервариабельные участки L- и Н-цепей объединяются вместе и образуют антиген-связывающий центр. Хотя изменение отдельных остатков в гипервариабельной части и приводит к образованию новых антигенсвязывающих центров, общая структура домена остается неизменной.

Антигены тканевой совместимости и система комплимента.

Как мы уже знаем, в основе процессов отторжения пересаженных тканей лежат иммунные реакции. В настоящее время установлено, что причиной отторжения является генетическое несоответствие клеток донора и реципиента. Обнаружены специальные участки генома, контролирующие этот процесс. Общее число их достигает нескольких десятков, но только один из них, называемый главным комплексом гистосовместимости, определяет быстрое отторжение. Продукты главного комплекса гистосовместимости, вызывающие реакцию отторжения и участвующие в иммунологическом узнавании, экспрессированы на поверхности клеток и называются антигенами гистосовместимости. В 1980 г. работа трех ученых, внесших решающий вклад в развитие представлений об антигенных главных комплексах гистосовместимости,- Ж. Доссе (Франция), Дж. Д. Снелл (США) и Б. Бенасерраф (США),- была отмечена Нобелевской премией. Принято различать антигены гистосовместимости I, II и III классов. Наиболее изучены антигены гистосовместимости I класса - основные трансплантационные антигены, по которым Т-киллеры изучают чужеродные клетки. Антигены гистосовместимости I класса есть на всех ядерных клетках организма. Они состоят из двух нековалентно связанных субъединиц: интегрального мембранного гликопротеина с молекулярной массой 45 000 (тяжелой субъединицы), имеющего три надмембранных домена (альфа- а3), и бета2-микроглобулина бета2М - неполиморфного полипептида с молекулярной массой 12000 (рис. 7).

Только тяжелая субъединица кодируется главным комплексом гистосовместимости, в то время как ген бета2-микроглобулина находится на другой хромосоме (второй у мыши и пятнадцатой у человека). Тяжелая цепь содержит ковалентно связанные олигосахариды и определяет антигенную специфичность молекулы.

Короткий С-концевой район тяжелой цепи ответствен за фиксацию молекулы в мембране и содержит два участка с молекулярной массой примерно по 5000 каждый, сильно различающихся по полярности аминокислот, входящих в их состав. Первый, содержащий С-концевую аминокислоту, состоит главным образом из полярных аминокислот и экспонирован в цитоплазму клетки. Второй, содержащий большое количество неполярных аминокислот (лейцин, изолейцин, валин), пронизывает гидрофобную область мембраны. Надмембранная часть молекулы может быть легко переведена в раствор путем ограниченного протеолиза с помощью папаина. Папаиновый фрагмент наиболее детально изучен химически.

На рисунке 8 схематически изображена последовательность событий, происходящих на мембране при активации комплемента.

Начальным этапом в цепи процессов активации комплемента является связывание его первого компонента С1 с комплементфик-сирующими участками антител (IgG и IgM), образовавшими комплексы антиген - антитело на поверхности клетки (рис. 8,а,б). В состав С1 входят три субъединицы Clq, Clr и Cls, выполняющие различные функции. Связывание компонента С1 происходит посредством белка Clq, который часто называют фактором узнавания. Эта цепь событий характеризует основной, или классический, путь активации комплемента. Далее в превращениях участвуют так называемые ранние компоненты комплемента (С4, С2, СЗ), которые последовательно активируются путем протеолитического расщепления. Поскольку активированный компонент расщепляет несколько молекул следующего компонента, активация ранних компонентов комплемента представляет собой усиливающийся каскад. Связывание с антителом Clq активирует субъединицу Clr в результате отщепления от нее части полипептидной цепи. Активированный Clr расщепляет Cls, превращая его в сериновую протеиназу. Таким образом, срабатывает пусковой механизм системы комплемента. Дальнейшие процессы активации, приводящие к лизису клеток, происходят уже без участия иммуноглобулинов или их комплексов с антигеном. Активированный Cls последовательно расщепляет четвертый и второй компоненты комплемента С4 и С2, которые прикрепляются к находящемуся рядом участку мембраны и образуют активный комплекс - так называемую СЗ-конвертазу (рис. 8 о - е).

СЗ-Конвертаза активирует третий компонент комплемента (СЗ) также путем расщепления его на два фрагмента - СЗа и СЗЬ (рис. 8, ж). Активированный СЗ (СЗЬ) ассоциируется с мембра-носвязанной СЗ-конвертазой, образуя новый ферментный комплекс - С5-конвертазу. Последняя активирует пятый компонент комплемента, находящийся в растворе, также путем отщепления полипептидного фрагмента от неактивного С5 (рис. 8, з).

Далее активированный пятый компонент комплемента (С5Ь) прикрепляется к мембране, и на нем собирается большой мембраноатакующий, литический комплекс, состоящий из поздних компонентов комплемента - С5b, С6, С7, С8 и С9 и осуществляющий лизис клеток мишени; все превращения происходят с участием ионов Са2+ и Mg2+ (рис. 8, и - м).

Наряду с классическим существует и так называемый альтернативный путь, или путь активации комплемента, происходящей без участия антител. Этот путь является, по-видимому, основным на ранних этапах борьбы организма с бактериальной инфекцией, когда антитела еще не образовались, представляя собой первую линию защиты. Альтернативный путь также заканчивается образованием С5-конвертазы, однако ее формирование происходит без участия С1, С2 и С4 компонентов за счет взаимодействия СЗ компонента с другими факторами (рис. 9). Реакция активируется полисахаридами клеточных стенок микроорганизмов и начинается с создания на мембране комплекса активированного СЗ компонента (СЗb) с фактором В. Последний расщепляется фактором D, что приводит к образованию альтернативной СЗ-конвертазы СЗbВb, которая стабилизируется присоединением пропердина Р. Добавление к этому комплексу дополнительных СЗЬ компонентов дает С5-конвертазу альтернативного пути C3bnBbP. Как и в классическом пути, образовавшаяся С5-конвертаза активирует пятый компонент комплемента, ответственный за сборку мембрано-атакующего комплекса.

Механизм цитолитического действия комплемента изучен недостаточно хорошо. Однако известно, что образующийся комплекс внедряется в гидрофобную зону мембраны и его компоненты формируют в ней воронку диаметром около 10 нм. Это приводит к нарушению целостности мембраны: выходу из клетки ионов, низ ко молекулярных компонентов цитоплазмы, белков, поступлению в клетку воды и т. п., что в конечном счете приводит к ее гибели и разрушению. Процесс настолько эффективен, что достаточно одного комплекса для разрушения клетки.

Необходимым условием для предотвращения разрушительного действия комплемента на собственный организм является наличие эффективных механизмов обратной регуляции. Существует два основных механизма такой регуляции. Первый - за счет действия ряда ингибиторных белков, которые связываются с активированными компонентами комплемента и блокируют их дальнейшее действие. Такие ингибиторы имеются, например, для С1 и СЗЬ. Второй механизм основан на нестабильности некоторых компонентов каскада, в частности С4.

В настоящее время практически все белки системы комплемента выделены в чистом виде и охарактеризованы, установлена полная первичная структура многих из них. Впервые работы по изучению структуры компонентов комплемента были проведены лабораториями Р. Портера (Великобритания) и Г. Фэя (США). В структурном отношении детально изучен фактор С1, функционирующая молекула которого содержит одну Clq, две С1г и две Cls субъединицы, связанные нековалентно. Белок Clq во многих отношениях уникален. Его молекула состоит из трех типов близких по природе полипептидных цепей (А, В и С) с молекулярной массой 23 500 каждая. В структуре каждой цепи можно выделить короткий М-концевой фрагмент, С-концевой глобулярный участок и достаточно протяженный коллагеноподобный район. Молекула Clq содержит в своем составе большое число остатков гидроксилизина и гидрокси-пролина, а также углеводы (глюкозу и галактозу).

А- и В-цепи связаны между собой дисульфидной связью, локализованной в N-концевых фрагментах, и нековалентно взаимодействуют с С -цепью. При этом их вытянутые части образуют единую трехспиральную структуру, подобную той, которая характерна для коллагена, тогда как С-концевые неколлагеновые фрагменты образуют единую глобулярную часть. Образованные таким способом структурные единицы могут легко димеризоваться за счет возникновения дисульфидной связи между N-концевыми фрагментами С-цепей. Нативная молекула Clq, имеющая молекулярную массу около 400 000, состоит из трех таких димеров, связанных нековалентными взаимодействиями между коллагеновыми частями цепей. Внешне такая молекула напоминает букет тюльпанов.

Необычная структура Clq-компонента комплемента объясняется характером выполняемых им функций. Глобулярные области ответственны за связывание с Fc-фрагментами иммуноглобулинов, причем для активации каскада необходимо, чтобы произошло связывание с участием как минимум двух "головок". Структурное разнообразие и полифункциональность характерны и для других компонентов комплемента.

Естественно, что активация комплемента может представлять известную угрозу и для организма хозяина. Однако в норме антитело фиксирует комплемент только на чужеродных клетках.

Медиаторы иммунного ответа

Интерфероны. В середине 30-х годов было установлено, что заражение животного каким-либо вирусом защищает его от последующего заражения другим вирусом; это явление получило название вирусной интерференции. Однако потребовалась почти четверть века, прежде чем был выделен в индивидуальном состоянии агент, ответственный за это явление. В 1957 г. английские ученые А. Айзеке и Д. Линденман впервые обнаружили белок, продуцируемый зараженными вирусом клетками, и назвали этот белок интерфероном.

Интерфероны - противовирусные агенты универсального действия. Они активны против любых вирусов, но, как правило, обладают видовой специфичностью - каждому виду животных свойствен свой интерферон. Как сейчас установлено, Интерфероны - это семейство белков, каждый со специфическим спектром деиствия. Существуют лейкоцитарные, или а-интерфероны, фибробластные, или бета-интерфероны, и, наконец, иммунные, или -гамма-интерфероны.

Структура интерферонов была установлена в конце 70-х - начале 80-х годов. Из природных источников эти белки выделяются в весьма небольших количествах, что затрудняло определение их аминокислотных последовательностей традиционными методами белковой химии. Оказалось, что интерфероны представляют собой небольшие белки с молекулярной массой около 17 500. Существенного прогресса удалось добиться на основе анализа соответствующих генов и сравнения полученных результатов с данными по частичной структуре белков. Определение структуры гена белка, для которого не было данных об аминокислотной последовательности, потребовало разработки специального подхода. Эта задача была успешно решена японским ученым Т. Танигучи на примере бета-ин-терферона. Позднее в лаборатории Ч. Вайсмана (Швейцария) была выяснена структура гена а-интерферона, а структура самого белка впервые определена Дж. Шайвели (США). На рисунке 10 приведена последовательность гена альфа-интерферона человека и выведенная из нее структура белка, содержащего 166 аминокислотных остатков.

Следует отметить, что у каждого вида животных имеется несколько альфа-интерферонов (в частности, у человека найдено 14 различных генов альфа-интерферонов), один или несколько бета-интерферонов и всегда один гамма-интерферон. Большинство интерферонов альфа-типа имеют негликозилированные пептидные цепи, тогда как бета и гамма-интерфероны являются гликопротеинами. Как следует из нуклеотидной последовательности, на начальном этапе синтезируется предшественник интерферона, содержащий сигнальный пептид из 23 аминокислотных остатков; последний отщепляется в результате процессинга при секреции белка. (бета- и альфа-интерфероны также синтезируются в виде предшественников (у человека бета-интерферон содержит 166 аминокислотных остатков, а гамма-интерферон - 143 остатка) .

альфа- и бета-интерфероны представляют собой типичные глобулярные белки (содержание альфа-спиральных структур составляет 40-75%). В альфа-интерферонах обнаружены две дисульфидные связи.

Механизм биологического действия интерферона в общих чертах выяснен. Интерфероны синтезируются и секретируются одними клетками и проявляют свой эффект, воздействуя на другие клетки, в этом отношении они подобны гормонам. Общая схема биологического действия интерферона представлена на рисунке 11.

Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны индуцируют синтез двух ферментов - 2/,5/-олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы, вероятно, за счет инициации транскрипции соответствующих генов. Оба образующихся фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочечных РНК, а именно такие РНК. являются продуктами репликации многих вирусов или содержатся в их вирионах. Первый фермент синтезирует 2',5'-олигоаденилаты (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу I; второй фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции IF2. Конечным результатом этих процессов является ингибирование биосинтеза белка и размножения вируса в инфицированной клетке, а затем ее лизис. Доказано, что существуют и альтернативные механизмы действия интерферонов (инактивация тРНК, вмешательство в процессы метилирования и т. п.).

Интерфероны - мощные противовирусные агенты. Они во все возрастающем масштабе используются в медицинской практике для лечения вирусных заболеваний, таких, как гепатит, энцефалит, бешенство, герпес и т. п. Имеются достаточно обоснованные данные об эффективности ряда интерферонов против некоторых форм рака. Интерфероны действуют в весьма небольших дозах при местном или внутримышечном применении; при этом в ряде случаев у пациентов отмечается некоторое повышение температуры. В мировой практике в настоящее время накапливается все больший опыт использования интерферонов при самых различных заболеваниях, в том числе при эпидемиях гриппа, аденовирусных инфекциях и т. п. Примечательно, что описаны случаи эффективного использования интерферонов для борьбы с вирусами не только сельскохозяйственных животных, но и многих культурных растений.

Широкому применению интерферонов в медицинской практике долгое время препятствовало отсутствие экономичных методов их получения. Первоначально наибольшее распространение получил метод производства лейкоцитарного интерферона на основе донорской крови (К. Кантелл, Финляндия, 1977). При этом лейкоциты подвергаются инкубации с каким-либо вирусом (например, вирус Сендай или вирус болезни Ньюкасла), в качестве компонента культуральной среды используется сыворотка крови человека или быка (иногда казеин молока). Последующая очистка с помощью хроматографических приемов дает достаточно концентрированный препарат интерферона.

Радикальным решением вопроса оказалось использование методов генетической инженерии. В частности, гены интерферона удалось экспрессироватъ в различных клетках, в том числе бактериальных, дрожжевых и клетках млекопитающих.

В процессе развития защитной реакции организма активированные лимфоциты секретируют набор белков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной системы; для таких белков часто используется термин интерлейкин.

Открытый в 1976 г. в лаборатории Р. Галло (США) интерлейкин 2 (IL2, ранее называвшийся клеточным ростовым фактором) вызывает пролиферацию активированных Т-лимфоцитов и занимает центральное место в каскаде интерлейкинов (или лимфокинов); он продуцируется зрелыми Т-лимфоцитами (Т-хелперами) в результате их стимуляции антигенами.

В индивидуальном состоянии интерлейкин 2 человека удалось получить на основе использования метода хроматографии высокого давления на обращенной фазе и применения моноклональных антител. Он представляет собой сравнительно небольшой гидрофобный белок, содержащий 133 аминокислотных остатка (рис. 12). Аминокислотная последовательность интерлейкина 2 человека определена по структуре соответствующего гена (Т. Танигучи, 1983) и затем подтверждена анализом самого белка. К одному из аминокислотных остатков (Thr-З) интерлейкина 2 присоединена углеводная цепь (за счет О-гликозидной связи), в состав которой входят остатки N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты (NeuNAc), галактозы (Gal) и N-ацетил га лактоза ми на (GalNAc). Характерно, что наличие углеводов не влияет на биологическое действие интерлейкина 2: рекомбинантный IL 2 имеет ту же удельную активность, что и природный.

Попытки выделить небольшой пептид, моделирующий активный центр молекулы, не увенчались успехом. Использование метода направленного точечного мутагенеза и моноклопальных антител к определенным участкам молекулы IL 2 показало, что активный центр формируется аминокислотными остатками, находящимися на N- и С-концах молекулы, сближенных в пространственной структуре молекулы за счет дисульфидной связи.

По характеру биологического действия интерлейкин 2 напоминает гормоны: он продуцируется клетками в весьма малых количествах, активен в концентрациях порядка нескольких пикомолей (на 1 мл), действует на клетку-мишень через соответствующий рецептор на ее поверхности (Kd = 3 - 5х10~12М). "Период полужизни" интерлейкина 2 в кровотоке измеряется минутами.

Интерлейкин 2, получаемый в настоящее время в промышленном масштабе на основе методов генетической инженерии, используется при лечении вирусных заболеваний, иммуно-дефицитов, некоторых форм рака.

Интерлейкин 1 (IL 1, или лимфоцитактивирующий фактор), впервые описанный И. Джери и Б. Ваксманом (США), продуцируется активированными макрофагами, а также полиморфноядерными лейкоцитами, эпителиальными клетками кожи и другими клетками. Он инициирует пролиферацию фибробластов, синтез простаглан-динов; основной же мишенью являются активированные Т-хелперы, которые в присутствии IL 1 секретируют IL2.

Интерлейкины 1 человека представляют собой белки, состоящие из 159 (IL la) и 153 (IL 1р) аминокислотных остатков. В ходе биосинтеза они получаются из высокомолекулярных белков-предшественников (271 и 269 аминокислотных остатков соответственно) .

В отличие от интерлейкинов 2 и 1, открытый Д. Иле с соавторами (США) интерлейкин 3 (из мыши, IL3) действует не на зрелые клетки иммунной системы, а на клетки-предшественники: он вызывает рост колоний стволовых клеток и предшественников бета-клеток. Источником интерлейкина 3 являются активированные Т-хелперы. По характеру своей активности IL 3 принадлежит к факторам, стимулирующим рост колоний различных клеток (CSF); он действует в концентрациях 10~11 - 10~12М. Интерлейкин 3 является гликопротеином, в состав которого входят 134 аминокислотных остатка,

К группе белков, продуцируемых активированными клетками иммунной системы и родственных интерлейкинам, следует отнести лимфотоксин и фактор некроза опухолей.

Лимфотоксин (LT) был впервые описан в конце 60-х годов как продукт активированных лимфоцитов, обладающий цитостатиче-ской активностью. Действие лимфотоксина на опухолевые клетки заметно усиливается в присутствии гамма-интерферона. Лимфотоксин человека является гликопротеином (171 аминокислотный остаток); углеводная цепь связана N-гликозидной связью с Asn-62 (рис. 130). Фактор некроза опухолей (TNF). TNF вызывает лизис некоторых типов опухолевых клеток. Он вырабатывается активированными макрофагами. Строение TNF человека, проявляющего заметную гомологию с лимфотоксинами, установлено на основе анализа нуклеотиднои последовательности соответствующего гена. Пептидная цепь его состоит из 157 аминокислотных остатков и синтезируется в виде предшественника (233 остатка). Оба цито-токсических фактора реагируют с одним и тем же рецептором поверхности опухолевой клетки (рис.13).

Следует отметить, что лимфотоксин и фактор некроза опухолей рассматриваются в настоящее время как весьма перспективные противораковые препараты и в настоящее время производятся и испытываются биотехнологическими фирмами и центрами в ряде стран мира, включая Россию.