Классический и неклассический методы описания кинетики ферментативных реакций.
Еще в 1913г. Михаэлисом и Ментен [1] была предложена схема ферментативного катализа с необратимым выходом продукта.
E + S ↔ ES → E + P
Схема I
Логика схемы I, метод ее описания предусматривает образование из реагирующего фермента Е и субстрата S фермент-субстратного комплекса ES с последующим его распадом, в результате которого образуется продукт P, а фермент и часть субстрата, возвращаясь в реактивную смесь, продолжают участвовать в ферментативной реакции. Подобно схеме этой простейшей односторонней реакции с одним субстратом, может быть составлено множество других, с различным количеством стадий, ферментов, субстратов, продуктов и объединенных общей логикой, классическим методом их описания. Основой этого метода является представление о стационарности:
Схеме I соответствую уравнение материального баланса по ферменту:
[E]0 = [E] + [ES], (I-1)
([E]0 - начальная концентрация фермента) и соотношение:
d[ES]/dt = K1[E][S] - K-1 [ES] - K2[ES], (I-2)
где t - время, K1, K-1, K2 - соответствующие константы скоростей реакции.
Из (I-1) и (I-2) при условии стационарности легко получить уравнение Михаэлиса-Ментен:
V = d[P]/dt = K2[ES] = (K2[E]0[S])/(Km +[S]), (I-3)
где Km = (K2 + K-1)/K1 - константа Михаэлиса-Ментен.
Различными авторами отмечались различные затруднения при его использовании, в частности, связанное с определением Km и максимальной скорости реакции [2].
Достаточно широкое применение получила и интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен:
[S]0 - [S] = K2[E]0 t + KmLn([S]/[S]0 , (I-4)
получаемое интегрированием в (I-3) с учетом:
d[P]/dt = -d[S]/dt, (I-5)
и уравнения материального баланса по субстрату:
[S]0 = [S] + [ES] + [P]. (I-6)
Интегральное уравнение Михаэлиса-Ментен хорошо соответствует экспериментальным данным. Вместе с тем оно, как и его дифференциальная форма, не свободно от недостатков.
Во-первых, диапазон применения этого уравнения должен быть ограничен условием избытка субстрата.
Во-вторых, условие стационарности не может выполняться.
Действительно, уравнения (I-3), (I-4) выводились из предпосылки о стационарности:
[ES] = const. Но тогда, в соответствие с (I-3): [S] = const. И, следовательно, из (I-5) и (I-3):
[S] = 0, [ES] = 0, [P] = const,
т.е. реакции вообще не происходит, а из (I-6) к тому же еще и следует, что этому отсутствию реакции соответствует [P] = [S]0, весь субстрат переработан в продукт. Таким образом, условие стационарности если и может выполняться, то лишь до некоторой степени, носит принципиально приближенный характер [ES] ≈ const. Остается открытым вопрос, не получаем ли мы при этом, повторяя вышеприведенный ход рассуждений:
[S] ≈ 0, [ES] ≈ 0, [P] ≈ const,
т.е. предыдущие результаты с той же степенью приближения, что и условия стационарности?
Следует отметить, что если уравнение Михаэлиса-Ментен (I-3) получено из каких-либо иных предпосылок, чем условие стационарности, то при его подстановке в (I-2), мы опять приходим к условию стационарности.
Закономерен вопрос, возможна ли логическая схема ферментативной реакции, которая бы:
а) Являлась модификацией классической схемы.
б) Позволяла корректно вывести уравнение для ферментативной реакции с необратимым выходом продукта без условия избытка субстрата.
в) При некоторых условиях позволяла приходить к результатам, близким к получаемым по формуле Михаэлиса-Ментен в ее дифференциальном и интегральном выражении.
Материальный состав схемы I неоспорим, для образования продукта необходимы субстрат и фермент. Образование фермент-субстратного комплекса также несомненно, без него необъяснима каталитическая способность фермента. К тому же, образование комплекса подтверждается экспериментами [3]. Естественно считать, что комплекс распадается, т.к. фермент способен переработать превосходящее его содержание количество субстрата, что требует возвращение в реактивную смесь освобождающегося из комплекса фермента. Сомнение вызывает лишь аналогичная участь, предписываемая схемой I освобождающемуся из комплекса субстрату. Нет неоспоримых доказательств в пользу того, что вышедший из комплекса субстрат во всех случаях, непременно, снова участвует в его образовании подобно ферменту.
Методами нестационарной кинетики определяются константы скоростей реакции. Но определение K-1 осуществляется не в результате прямого измерения соответствующей скорости, а так или иначе связано с расчетами, основанными на соотношении (I-2). С другой стороны, для ряда ферментативных реакций K-1 = 0, K-1 ≈ 0 [4-5].
Понятие обратимости обычно ассоциируется с возвращением в реактивную смесь всех участвующих в прямой реакции реагентов, что, например, относится к субстрату в реакции, протекающей по схеме I. Она предусматривает возвращение части субстрата в реактивную смесь и превращение другой ее части в продукт. Соотношение этих частей не регламентировано и сомнения относительно обязательного возвращения субстрата в реактивную смесь не рассеиваются. Тем не менее, правомерно предположение о том, что когда у одного из реагентов есть возможность на возвращаться в реактивную смесь, такая возможность реализуется.
Ранее, совместно с П.А. Подрабинеком, нами был предложен неклассический метод описания кинетики ферментативных реакций. Суть его в следующем.
Фермент Е соединяется с субстратом S в фермент-субстратный комплекс ES. Молекула фермента способна к конформационным изменениям, сопряженным с изменением ее энергетического уровня и переходом субстрата к активированному состоянию Sa. В результате комплекс распадается с необратимым превращением активированного субстрата Sa в свободный (несвязанный) продукт Р. Поэтому скорость распада фермент-субстратного комплекса определяет скорость образования продукта, что соответствует релаксационной концепции Л.А. Блюменфельда [6]. В соответствие с этим принципом лимитации активированный субстрат Sa превращается в продукт и не возвращается в реактивную смесь в качестве исходного (не активированного) субстрата S.
Вышеизложенным представлениям соответствует следующая схема протекания ферментативной реакции:
E + S → ES → ESa → E + P
Схема II
Для удобства стадию активацию субстрата в фермент-субстратном комплексе будем опускать, так как это не отражается на соотношениях.
Схеме II соответствует:
d[ES]/dt = K1[E][S] - K2[ES] (I-7)
d[P]/dt = K2[ES] (I-8)
d[S]/dt = - K1[E][S] (I-9)
Из (I-1), (I-6), (I-8), (I-9) следует:
[P] = K2[E]0 t + (K2/K1)Ln([S]/[S]0) (I-10)
Интегральное уравнение Михаэлиса-Ментен (I-4) является частным случаем уравнения
(I-10), если в последнем пренебречь малой линейной величиной [ES] с учетом (I-6). Из
(I-7) следует, что в некоторой временной точке достигается максимальная скорость реакции, зависимость которой от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (I-3) при К-1 = 0. К сожалению, мы не нашли в литературе данных (с учетом [ES]), позволяющих непосредственно проверить уравнение (I-10). Следует полагать, что оно справедливо по крайней мере в тех же случаях, при которых применяется интегральное уравнение Михаэлиса-Ментен.
II
Обобщение неклассического метода описания кинетики ферментативных реакций.
Предложенный метод можно распространить на более сложные случаи ферментативного катализа.
Рассмотрим многостадийную ферментативную реакцию. Стадию реакции обратимого образования фермент-субстратного комплекса и последующую стадию необратимого образования продукта назовем ступенью реакции. Таким образом, если в ферментативной реакции имеется n обратимых стадий образования фермент-субстратного комплекса с последующими стадиями необратимого образования продукта, подобная реакция является n-ступенчатой. Такой ферментативной реакции соответствует схема III.
E + S1 → ES1 → E + S2 → ES2 → ... E + Si → ESi → ... E + Sn → ESn → E + P.
Схема III
Индекс i, указывающий номер ступени, пробегает значения от 1 до n. Индекс j пробегает значения от 1 до i. Фермент Е обратимо реагируя с субстратом Si, образует фермент-субстратный комплекс ESi. V1i - скорость прямой реакции, V2i - скорость обратной реакции, K1i и K2i - соответствующие константы скоростей. Выходящий из фермент субстратного комплекса субстрат необратимо образует продукт, являющийся субстратом следующей ступени реакции, вплоть до образования конечного продукта Р.
Уравнение (II-1-7) показывает, как меняются во времени концентрации промежуточных соединений. Участие в i-ой ступени реакции только части промежуточного продукта из
(i-1)-ой ступени реакции, легко учитывается в (II-1-1), (II-1-7).
2) Ферментативные реакции n ферментов с m субстратами.
Рассмотрим совокупность ферментативных реакций n ферментов с m субстратами, в которой каждый фермент может реагировать с каждым субстратом. В ходе реакции образуется (nхm) продуктов.
Будем нумеровать ферменты индексом i, пробегающим значения от 1 до n. Субстраты будем нумеровать индексом j, пробегающим значения от 1 до m. На схеме IV представлена реакция произвольно выбранного фермента Ei c произвольно выбранным субстратом Sj с образованием фермент-субстратного комплекса EiSj и последующим необратимым образованием продукта Pij.
Ei + Sj → EiSj → Ei + Pij
Схема IV
[Ei]0 - начальная концентрация фермента, [Sj]0 - начальная концентрация субстрата. V1ij - скорость прямой реакции, V2ij - скорость обратной реакции, K1ij и K2ij - соответствующие константы скоростей реакции. Концентрации субстратов не равны нулю.
Уравнение (II-2-6) выражает временную зависимость концентраций любого субстрата и образованных продуктов для совокупности реакций n ферментов с m субстратами. При
n = 1 мы получаем реакцию одного фермента с m субстратами, и для любых двух субстратов S1 и S2, чьи концентрации не равны нулю, выполняется соотношение:
Из обширной области ингибирования ферментативных реакций рассмотрим случай торможения простейшей ферментативной реакции вследствие необратимого образования ингибитором I с ферментом Е комплекса EI. При этом в ходе самой ферментативной реакции, в присутствие субстрата S, необратимо образуется продукт Р. Такого рода реакции представлены на схеме V.
E + S → ES → E + P , E + I → EI .
Схема V
Пусть Vs - скорость образования фермент-субстратного комплекса и Ks - соответствующая константа скорости. Vi - скорость связывания ингибитором фермента и Ki - соответствующая константа скорости. Рассмотрим случай, когда реакция прекращается вследствие полного связывания ингибитором фермента. Согласно этому, начальная концентрация субстрата должна быть достаточна велика, чтобы реакция не прекратилась в результате его израсходования, и начальная концентрация ингибитора должна превосходить начальную концентрацию фермента:
[S]0 > [I]0 > [E]0 .
Запишем уравнения материального баланса:
[E]0 = [E] + [ES] + [EI] , (II-3-1)
[I]0 = [I] + [EI] , (II-3-2)
[S]o = [S] + [ES] + [P] (II-3-3)
Запишем очевидные соотношения:
d[S]/dt = - Vs = - Ks[E][S] , (II-3-4)
d[I]/dt = - Vi = - Ki[E][I] , (II-3-5)
На основании (II-3-4), (II-3-5) легко получить:
(1/Ks)Ln([S]/[S]0 = (1/Ki)Ln([I]/[I]0 . (II-3-6)
При полном израсходовании фермента к концу реакции:
По уравнению (II-3-7) удобно определять концентрацию продукта, образованного к концу реакции. Примечательно, что уравнение (II-3-6) аналогично уравнению (II-2-7), относящемуся к реакции одного фермента с несколькими субстратами. Последний случай также можно рассматривать как пример ингибирования ферментативной реакции.
Заключение
Возможна модификация классической схемы ферментативного катализа с необратимым образованием продукта. В рамках предложенного неклассического метода соблюдаются следующие положения:
а). При распаде фермент-субстратного комплекса субстрат не возвращается в реактивную смесь.
б). Скорость распада фермент-субстратного комплекса лимитирует скорость ферментативной реакции.
В соответствие с этими положениями кинетика ферментативной реакции описывается уравнениями, в частных случаях приводящих к ранее известным закономерностям: уравнению Михаэлиса-Ментен в его интегральном выражении, соотношениям для максимальных скоростей реакции.
Предложенный неклассический метод описания кинетики ферментативных реакций может быть распространен на более сложные случаи ферментативного катализа:
а). Многостадийную ферментативную реакцию.
б). Ферментативные реакции произвольного количества ферментов с произвольным количеством субстратов.
5.Л.Уэбб, Ингибиторы ферментов и метаболизма, "Мир", М.,(1966).
6.Л.А.Блюменфельд, Проблемы биологической физики, "Наука", М.,(1977).
Примечание
У этой работы трудная судьба. Основополагающее уравнение было мной найдено в начале 70-х. Совместно с моим отцом, Пинхосом Абрамовичем Подрабинеком, мы идею развили и написали статью. Но публиковаться диссидентам, даже в научных журналах, не представлялось возможным. Статья нелегально отправилась заграницу, где и затерялась... В 1977-1983г. я удостоился чести пребывать политзаключенным. В 1988г., снова совместно с П.А. Подрабинеком, мы написали новую статью, немного переработав предыдущую. Зарегистрировали ее в нотариальной конторе и, кажется, снова отправили заграницу. Вестей о ней мы не получили... В 2000г, основательно расширив статью, я отправил ее в журнал "Молекулярной биологии". Журнал статью не принял, как "не подходящую по профилю", посоветовав предложить другим изданиям. Тогда статья отправилась в журнал "Биофизика", откуда вскоре пришла отрицательная рецензия. Совершенно неосновательная, рецензент попросту отписался. Естественно, я отправил аргументированное возражение на рецензию. И получил новую отрицательную рецензию, от того же рецензента. В стиле "работа не подходит, потому что не подходит". Я переписывался с редакцией 4 года, получив 4 отрицательные рецензии и написав 4 на них возражения, последовательно опровергая доводы оппонента. Исчерпав все аргументы, неведомый рецензент снова вернулся к первоначальным возражениям, явно приглашая меня ко второму кругу переписки. Но я уже наигрался... И то сказать: 100 лет люди благополучно эксплуатировали привычный метод, написали множество работ, защитили уйму диссертаций, воспитали поколения учеников. Но вот приходит какой-то наглец и вышибает табуретку из-под ног! В российской науке, как в российских судах: истина не нужна, доказательства не принимаются. Впрочем, я и не претендую на обладание несомненной истиной. Но понятно, что уравнение Михаэлиса-Ментен теоретически несостоятельно, а новый метод заслуживает рассмотрения, аргументированной критики, экспериментальной проверки. Следовательно, работа должна быть опубликована! Я не расстраивался. Склонен считать, что делаю одолжению журналам, поделившись с ними своим добром, т.е. работой. В редакциях, почему-то полагают иначе... Более 100 лет тому назад предложили первое уравнение. Почти 50 лет тому назад было найдено новое уравнение, включающее первоначальное как частный случай. Думаю, лет через 100 истина прояснилась бы. Но у меня нет такого времени в запасе. И немного мучает совесть. Все-таки есть добросовестные исследователи, моя скромная работа могла бы кому-то пригодиться. Связываться с официальной наукой нет ни сил, ни желания - я уже не молод. Вот почему публикую в адаптированном к "самиздату" виде, предлагая ее вниманию уважаемого читателя. К сожалению текст, а особенно формулы, не слишком хорошо приспосабливаются к формату сайта. Нижние индексы не прописываются. Вставки "плывут". Возможны и другие неприятности при чтении... Приношу за них извинения.